缺氧誘導因子-1/自噬在硫化氫預處理大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用與機制研究

毛忠文 鄧秋芳 李靜 王新云 甘金城 駱福秀

心肌缺血再灌注是引起冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)心肌損傷的重要病理機制，其常見于冠心病溶栓等治療中，有研究表明，在心肌缺血再灌注過程中會產生的大量ROS，是導致再灌注損傷的重要機制[1]。心肌缺血再灌注損傷會導致治療效益低下，且有多種機制能夠參與心肌缺血再灌注損傷，主要包括自噬、內質網應激、血管皮內細胞功能障礙等。自噬是真核細胞中代謝調節的主要機制，能夠在缺氧、缺血再灌注等情況下，誘導自噬產生，尤其是在缺血再灌注后會大量產生自噬小體。HIF-1α屬于一種轉錄因子，多存在于線粒體中[2]。硫化氫被認為是一種新型的神經調節因子和信號傳遞因子，且在多個器官及組織中均有所發現，當機體在病理情況下，其能夠發揮抗炎、抗氧化作用且對神經起著保護作用[3]。本文中，建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，對缺氧誘導因子-1/自噬在心肌缺血再灌注損傷大鼠中的作用，為治療心肌缺血再灌注損傷提供了新的循證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動物：選取SPF級SD健康大鼠40只，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，鼠齡(3.8±0.3)個月，體重(229.6±11.8)g。大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養時間1周。本研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：人抗大鼠LDH抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)；大鼠抗小鼠HIF-1α抗體(上海優寧維生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠LC3Ⅰ抗體、人抗大鼠LC3Ⅱ抗體(北京泰澤瑞達科技有限公司)；兔抗大鼠P62抗體(艾美捷科技有限公司)；兔抗小鼠Beclinl-1抗體(上海信裕生物工程有限公司)；SOD ELISA試劑盒、cTnT ELISA試劑盒、CK-MB ELISA試劑盒(上海撫生實業有限公司)；MDA ELISA試劑盒(上海紀寧生物科技有限公司)；T-AOC ELISA試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2 方法 隨機選取40只大鼠中10只作為對照組(C組)，10只作為預處理組(H組)，注射5 μmol/kg的硫化氫于大鼠左側腎動脈，剩余20只大鼠采用覃琴等[4]誘導建立體內心肌缺血再灌注(I/R)模型，使用50 mg/kg的戊巴比妥鈉將大鼠進行麻醉處理，將導管插入右側頸內靜脈以及頸內動脈以便靜脈給藥和血氣分析、血壓檢測。切開氣管后行氣管插管，連接呼吸機行呼氣末正壓通氣，恒溫控制儀維持大鼠體溫36～37℃，行左胸切開術打開心包，在左心耳下緣對冠狀動脈左前降支進行結扎，縫線末端套入自制圈套管，靜止平衡30 min，使用止血鉗阻斷冠狀動脈左前降支供血，當心外膜發紺蒼白則表示缺血模型建立成功，松開圈套管進行灌注，可見心外膜重新充血，表明心肌缺血再灌注(I/R)模型建立成功。后經大鼠左側腎動脈給予5 μmol/kg的硫化氫，分為HI組，對照組和模型組不作任何處理。所有大鼠給硫化氫1周，靜脈采血后處死，以半徑為5 cm、轉速3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存，待用。取心臟組織，在4%多聚甲醛進行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，之后脫水、透明，切片厚度4 μm，待封片晾干后顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理學表現。

1.3 觀察指標

1.3.1 心電圖檢測:將針形電極按紅、綠、黑分別插入四肢皮下，采用XD-7100單導標準肢體Ⅱ導聯記錄大鼠造模前后心電圖變化。

1.3.2 SOD、MDA水平及T-AOC含量檢測:采用比色法對超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA水平及總抗氧化能力(T-AOC)含量進行檢測。

1.3.3 心功能指標:采用二維超聲對左心室收縮末期壓力(LVESP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)進行檢測；使用AisualSonic Vevo 2100型彩色超聲診斷儀，電子探頭，14 mHz，對左心室射血分數(FS)、短軸縮短率(EF)進行檢測。

1.3.4 心肌酶水平檢測:采用酶聯免疫法對肌酸激酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌鈣蛋白(cTnT)水平進行檢測，取50 mmol/L碳酸鹽包緩沖液對CK-MB、LDH、cTnT進行稀釋，且加入聚苯乙烯的反應孔中，加蓋處理后，在4℃下置留24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋待測標本0.1 ml，加入陽性、陰性對照標本，在42℃下置留60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入CK-MB、LDH、cTnT抗體0.1 ml，再次置留60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔內，終止反應。使用酶標儀檢測A450，分析CK-MB、LDH、cTnT水平。

1.3.5 心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區占心室比比較:再灌注結束后，將前降支重新結扎，采用TTC法對心肌梗死面積進行檢測，采用Image Pro-Plus軟件分析心肌梗死面積和心肌缺血面積。

1.3.6 HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白檢測:采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白進行檢測，嚴格按照定量PCR儀的操作說明書進行。分別加入稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μl，MgCl2溶液1.5 μl，上游引物和下游引物0.5 μl，然后加水制成25 μl的反應體系。在94℃環境中反應1 min，55℃環境中反應1 min，72℃環境中反應1 min，循環35次，72℃環境中反應延長5 min，最少重復3次。采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62表達水平。HIF-1α引物序列：上游:5’-ATGCTTATATCTGGAAGGTATGTGG’；下游：5’-AAAGAGCAAGGGAACGAAAA-3’；LC3Ⅰ引物序列：上游:5’-TCCTGGATAAGACCAAGTTTCTG’；下游：5’-ATAGATGTCAGCGATGGGTGTG-3’；LC3Ⅱ引物序列：上游:5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’；下游：5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’；P62引物序列：上游:5’-AGCTGCCCTCAGCCCTCTA’；下游：5’-GGCTTCTCTTCCCTCCATGTT-3’；GAPDH引物序列：上游:5’-GATTTGGCATTGTTGAGGG-3’；下游：5’-TGCTATCGCCTATGAAGTCC-3’。

1.3.7 HIF-1α/Autophagy通路蛋白檢測:使用Western blot檢測3組大鼠HIF-1α/Autophagy信號通路蛋白表達量，提取小鼠肺組織中樣品總蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液，每孔劑量為20 μg。進行電泳，電壓為120 V，進行1.5 h后，轉至形成PVDF膜，轉膜完成后，使用5%的脫脂奶粉進行封閉，室內進行，加入一抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶2 000稀釋)或在溫室下孵育12 h。在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶5 000稀釋)，室內震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內參蛋白是GAPDH。

2 結果

2.1 病理組織學觀察 C組大鼠心肌纖維排列緊密有序，肌段清晰，線粒體豐富；H組大鼠心肌細胞排列整齊，部分細胞水腫；I/R組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞水腫、壞死明顯，炎性細胞浸潤；HI組大鼠損傷減弱，纖維外觀較紊亂，脂肪和空泡變性豐富。見圖1。

C組H組I/R組HI組

2.2 4組大鼠心電圖ST段變化 缺血前4組大鼠心電圖ST段比較，差異無統計學意義(P>0.05)；缺血后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)；再灌注后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠心電圖ST段變化

2.3 4組大鼠心肌組織中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比較 H組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平低于C組大鼠，且MDA水平高于C組，但差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平均低于C組、H組、且MDA水平高于C組、H組，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平高于I/R組，且MDA水平低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心肌組織中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比較

2.4 4組大鼠心功能指標比較 H組大鼠LVESP、FS、EF低于C組大鼠，且LVEDP高于C組大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠LVESP、FS、EF低于C組、H組大鼠，且LVEDP高于C組、H組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠LVESP、FS、EF高于I/R組，且LVEDP低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心功能指標比較

2.5 4組大鼠心肌酶水平比較 H組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C組大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C組、H組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠心肌酶水平比較

2.6 4組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區占心室比比較 I/R組、HI組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區占心室比高于C組、H組，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區占心室比低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

2.7 4組大鼠心臟組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表達量比較 H組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達量均高于C組，且LC3Ⅰ低于C組，但差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達量均高于H組、C組大鼠，且LC3Ⅰ低于H組、C組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表達量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表6。

表5 4組大鼠心肌缺血面積、心肌梗死面積、梗死區占心室比比較

圖2 4組大鼠HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62熒光定量RT-PCR圖

表6 4組大鼠心臟組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表達量比較

2.8 4組大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表達量比較 H組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達量均高于C組，且LC3Ⅰ低于C組，但差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達量均高于H組、C組大鼠，且LC3Ⅰ低于H組、C組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表7，圖3。

表7 4組大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表達量比較

圖3 心肌組織HIF-1α/Autophagy通路蛋白HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白Western blot圖

3 討論

心肌缺血再灌注是由于多種細胞因子和信號通路的參與的復雜病理過程，對心肌缺血再灌注患者的預后和治療帶來了嚴重的影響[5]。心肌缺血再灌注損傷是指心肌長時間缺血后恢復供血后心肌損傷更加嚴重的一種病理現象。有研究表明，恢復組織灌注是減少心肌缺血后損傷的最有效辦法[6]。但缺血心肌恢復血液再灌注后可能會導致心肌能量代謝障礙、心律失常、心肌細胞超微結構的變化等，進一步加重各方面的損傷，即心肌缺血/再灌注損傷，成為缺血性心肌病治療的障礙之一，臨床治療應盡量減少甚至避免心肌缺血再灌注所帶來的損傷[7,8]。

硫化氫是一種具有臭雞蛋氣味的窒息性氣體，外源性硫化氫進入人體將產生細胞毒理性作用，表現為中樞神經系統癥狀和窒息癥狀[9]。內源性硫化氫具有多種生理功能，且與多種心血管疾病有關。大鼠心肌I/R損傷模型已被廣泛用于心肌I/R損傷實驗中。有研究表明，當心肌損傷時，心電圖ST段會有明顯抬高[10]。本實驗發現，再灌注后I/R組、HI組大鼠心電圖ST段高于H組，且HI組大鼠心電圖ST段低于I/R組，此結果說明，再灌注能夠降低大鼠的心電圖ST段抬高，有利于心肌I/R損傷大鼠的恢復。自由基蓄積過多會直接導致核酸、蛋白質等物質的過氧化，破壞膜結構，最終導致心肌的不可逆損傷，其主要表現為MDA含量增加以及SDO和T-AOC活力下降；同時還會出現大片的心肌梗死區域，導致心肌組織和結構發現明顯的改變[11]。在本文中發現，HI組大鼠心肌組織SOD、T-AOC水平及心肌梗死面積高于I/R組，且MDA水平低于I/R組，此結果可得，硫化氫能夠降低大鼠心肌損傷程度，減少心肌梗死范圍，保護心功能。與杜靖等[12]研究結果一致。

HIF-1α是一種核轉錄因子，其主要存在于線粒體中，能夠抑制電子產物ROS的產生，還能夠通過Beclinl-1/Bcl-2途徑促進線粒體的自噬[13]。HIF-1α的表達主要受其濃度的調節，是HIF-1發揮的重要亞基，在常氧條件下能夠別快速溶解，且在低氧狀態下降解受阻，表達增加，并能夠通過調控其下游蛋白發揮作用[14]。自噬被認為在MIRI中發揮重要作用，在正常生理狀態下，其在心肌細胞中低量存在，當機體處于缺氧、缺血等狀態下，其水平會顯著增加。自噬會促進細胞內重要功能的胞質蛋白和細胞器降解，從而為細胞的生存代謝過程中提供營養[15]。高魯方等[16]研究表明，心肌缺血再灌注損傷過程中自噬起重要作用，小劑量衣霉素誘導ERS預處理可在缺血期引起適度的細胞自噬，有助于維持心肌細胞的內穩態，產生一定程度的心肌保護效果。LC3主要分為Ⅰ型和Ⅱ型，正常情況下，細胞內合成的LC3經過加工形成Ⅰ型，則呈常規表達；當自噬發生后，LC3Ⅰ的表達急劇下降，LC3Ⅱ表達顯著升高，因此，通過LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的比值，可以檢測細胞自噬水平[17]。P62是一種泛素結合蛋白，且與蛋白質的泛素化密切相關，其能夠參與多種細胞自噬及調控過程[18]。自噬中，其能夠與蛋白質泛素相結合，與自噬小體內膜LC3Ⅱ形成復合物，并被自噬溶酶體一同降解。Beclinl-1是自噬調控的關鍵蛋白之一，能夠參與自噬體膜的形成，誘導自噬發生[19,20]。因此在本文中對4組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白進行檢測，結果顯示，HI組大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達量均低于I/R組，且LC3Ⅰ高于I/R組，此結果說明，硫化氫可有效改善心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表達量，效果顯著。

綜上所述，硫化氫對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用，能夠縮小心肌梗死面積，其作用機制可能與HIF-1α/Autophagy通路有關，抑制再灌注期自噬的表達，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。