骨骼肌鈍挫傷的損傷與修復機制研究進展

林建平，王 浩，郭明玲，王詩忠，陳少清

1 福建醫科大學健康學院，福建 福州 350122；

2 福建省康復養老與產業促進協同創新中心，福建 福州 350122；

3 福建醫科大學附屬第一醫院，福建 福州 350005；

4 福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122

骨骼肌鈍挫傷（skeletal muscle contusions，SMC）是臨床常見的運動損傷疾病［1-2］，在骨骼肌損傷中占比超過60%［3］。盡管SMC 可以自愈，但是損傷后影響骨骼肌的結構和功能，導致肌肉萎縮、痙攣、疼痛及二次損傷［4］。目前國內外學者對骨骼肌鈍挫傷的損傷與修復機制尚未定論，但肌衛星細胞增殖和分化學說、Ca2+介導的細胞膜修復學說、內質網應激學說、自噬學說是SMC 損傷與修復研究的重點，且至今未有相關的SMC 機制研究進展報道，因此有必要圍繞以上學說作一綜述。

1 骨骼肌損傷后修復進程

骨骼肌損傷后的修復大致可分為3 期，分別是損傷期、修復期和組織塑性期。

1.1 損傷期

此期組織處于壞死與炎癥階段，肌纖維、血管、電解質和神經遭到不同程度的破壞。細胞膜破損，肌漿中大量Ca2+外流，造成損傷局部出現高鈣環境，激活鈣依賴的各種機體應激反應。此外，眾多炎癥因子聚集到損傷部位。損傷24 h 后就開始出現新生血管，新生血管將大量的中性粒細胞、巨噬細胞和T 淋巴細胞運送到損傷部位，參與局部的炎癥反應。

1.2 修復期

肌細胞的再生出現在骨骼肌損傷后3 d 左右，參與肌細胞再生的是肌衛星細胞，肌衛星細胞在相關信號通路的調控下分化、增殖形成肌纖維。研究表明，肌衛星細胞增殖和分化大約可持續10 d［5］。此階段多種肌再生因子及血管再生因子參與肌肉和血管的再生，其中與SMC 后修復相關的血管再生因子主要是低氧誘導因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）、血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth fac?tor，VEGF）。劉曉光等［6］研究表明，HIF-1a、Ang-1在SMC 后表達升高，VEGF 表達顯著降低，推測HIF-1a、Ang-1 參與了骨骼肌損傷后血管再生以及骨骼肌再生。

1.3 組織塑性期

傷后14 d～2 個月，細胞外基質會加速增殖，發生纖維化。在這個過程中轉化生長因子-β1（trans?forming growth factor-beta 1，TGF-β1）起關鍵作用，TGF-β1 可直接刺激成纖維細胞產生大量細胞外基質蛋白，還可抑制細胞外基質蛋白的降解，導致纖維化的發生［7］，適度的纖維化有利于傷口的愈合，但是過度的纖維化會降低肌肉的收縮功能及運動能力。

以上3個階段不是孤立發生的，而是重疊交錯，緊密聯系，每個階段的具體作用機制錯綜復雜。以下分別從肌衛星細胞增殖和分化學說、Ca2+介導的細胞膜修復學說、內質網應激學說以及自噬學說進行闡述。

2 肌衛星細胞增殖和分化學說在SMC 方面的相關研究

肌再生在骨骼肌損傷與修復中至關重要，肌再生依賴于周圍衛星細胞的分化、增殖，促進骨骼肌再生，從而修復受損肌肉的功能［8］。當肌肉受損后，處于靜止狀態的衛星細胞被激活，引起細胞增生、分化，最終融合成多核肌管，并與受損的肌纖維結合，形成新的肌纖維細胞［9］?？梢?，衛星細胞是參與運動損傷后肌肉再生的結構生理學基礎［10］。同時，衛星細胞在參與肌肉生長和肌肉再生過程中還受到多條信號通路的調控。

2.1 RBP-Jκ/Notch 信號通路調控肌衛星細胞分化成肌研究

在成人中，Notch 信號通路對肌肉、腦、皮膚、腸道以及血管等組織的干細胞起重要調控作用［11-16］，在哺乳動物中，Notch 信號通路受體和配體結合后，引起一系列的受體蛋白水解，并釋放出命名為NICD（noth intracellular domain）的Notch 胞內區域［17］，NICD 被轉移到細胞核，然后與RBP-Jκ（recombina?tion signal binding protein-Jκ）重新結合［18］，RBP-Jκ是經典Notch 信號通路中關鍵的轉錄調節因子。潘同斌等［19］研究表明，SMC 可以使大鼠骨骼肌的血清中的RBP-Jκ 含量上升，RBP-Jκ 可能在骨骼肌衛星細胞激活及損傷與修復中起著正向調節的作用。BJORNSON 等［20］研究證實，特異性地敲除骨骼肌RBP-Jκ 基因，將導致衛星細胞耗竭，并且肌肉將喪失損傷后修復的能力，而導致衛星細胞耗竭的原因不是衛星細胞的凋亡，相反，這些RBP-Jκ 基因缺失的衛星細胞自發激活，其中大多數細胞還沒有進行分裂就異常分化，并與鄰近的肌纖維融合，導致肌衛星細胞不斷減少。

以上研究顯示，Notch 信號通過調控肌衛星細胞自我更新和分化來維持肌干細胞的穩態，這一過程對于正常的肌生成與修復是至關重要的。

2.2 Wnt信號通路調控肌衛星細胞分化成肌研究

已有研究結果表明，Wnt 信號通路調控是胚胎成肌過程中必不可少環節［21］。那么其在成熟肌纖維再生過程中是否具有同樣重要的作用？潘同斌等［22］研究發現，大鼠鈍挫傷后骨骼肌衛星細胞中AXIN、GSK-3β 的含量的表達下降，而肌衛星細胞明顯增殖。GSK-3β、AXIN 屬于Wnt 信號通路負性調控因子，其表達水平下降，可激活Wnt 信號通路。其研究提示骨骼肌損傷與修復可能與該通路的激活有關。同樣地，陳宗正等［23］采用Wnt 信號通路的抑制劑EGCG 來抑制豬骨骼肌衛星細胞Wnt信號通路，發現大量細胞停滯在G1 期，表明細胞的增殖被抑制。以上研究表明，Wnt 信號通路可能在骨骼肌損傷與修復中發揮正向調控作用。然而，ZHAO等［24］通過一種心臟毒素（cardiotoxin）來誘導肌肉再生，沒有檢測到經典Wnt信號通路中關鍵因子（Wnt-Frizzled-bgr；-catenin-Lef1/Tcf1）的基因表達，僅在某些時間位點上觀察到β-catenin 的表達，但是與對照組比較差異無統計學意義，其研究表明在肌肉再生過程中，Wnt信號通路處于抑制狀態。

因此，關于Wnt 信號通路在成熟骨骼肌再生過程中的作用是存在爭議的，激活Wnt 信號通路是否有利于骨骼肌損傷與修復需要更多的研究來進行論證。

2.3 P13K/Akt/mTOR 信號通路調控肌衛星細胞分化成肌研究

P13K/Akt/mTOR 信號通路對肌衛星細胞分化、成肌過程具有正向調控作用［25］。ZHANG 等［26］使用mTORC1 抑制劑-雷帕霉素（rapamycin）來抑制TOR信號通路，結果發現肌纖維細胞的分化過程被抑制。張安寧等［27］發現阻斷該通路后，MyoD1、MyoG和MyHC（成肌分化標志基因）的表達下降。HAN等［28］研究表明，胰島素樣生長因子1 和亮氨酸可以通過mTOR 途徑激活豬的肌衛星細胞。PEREIRA等［29］研究表明，亮氨酸通過調控PI3K/Akt/mTOR 通路促進衛星細胞增殖來提高老年大鼠骨骼肌的再生能力。

以上研究表明，P13K/Akt/mTOR 信號通路對肌衛星細胞的成肌分化具有正向調控作用，能夠促進骨骼肌再生。

3 Ca2+介導細胞膜修復與SMC研究

細胞膜損傷后的自我修復能力對細胞的存活至關重要。當受損時，真核細胞能夠在幾秒鐘內恢復細胞膜的完整性，從而避免了細胞質泄漏和細胞死亡。這一過程是由細胞外Ca2+流入驅動的［30-31］，它觸發了大量的細胞內效應，參與了質膜再密封的過程。細胞膜修復的一個重要標志是細胞內囊泡的募集及其在受損部位的胞外分泌［32］。

骨骼肌鈍挫傷后大多數是完成自我修復的過程，在這一過程中，Ca2+對于介導骨骼肌細胞膜的自我修復能力起著重要的作用。MELLGREN 等［33］研究表明，Ca2+從受損的細胞膜內流到細胞內，并且大量Ca2+內流激活相關的鈣蛋白酶，從而將Dysferlin水解成mini-dysferlinC72［34］。這一過程在骨骼肌損傷與修復中起關鍵作用，研究表明Dysferlin 通過調節損傷引發的囊泡融合參與質膜修復，被認為是鈣依賴性肌膜修復的關鍵介質［35］。在去極化型電壓門控鈣通道（L-型VGCC）協調下，富含mini-dysfer?linC72 的細胞質囊泡被迅速募集到膜損傷部位，并與MG53 修飾的質膜間隔融合，最終標記并與暴露出來的磷脂相結合，類似補丁作用，嵌入到膜損傷位點，從而完成修復過程［36］。見圖1。

圖1 Ca2+介導細胞膜修復Figure 1 Calcium-dependent plasma membrane repair

4 內質網應激與SMC研究

骨骼肌擁有高度發達的內質網，內質網又被稱為肌漿網，不僅可以作為鈣泵完成肌肉的興奮收縮偶聯反應，還可對各種生理或病理性刺激迅速做出反應［37］。骨骼肌損傷后引起鈣泵結構受損或功能下降使Ca2+回收受阻，Ca2+失調通過促進線粒體的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和擾亂內質網腔內的蛋白質折疊，有助于異常的蛋白質生成［38］，內質網中異常折疊蛋白生成增多，超過其閾值并發生聚集、滯留，最終誘導內質網過度應激［39］。FERNáNDEZ 等［40］采用離心運動誘導骨骼肌損傷，結果發現內質網應激標志蛋白（GRP78）表達明顯增加。目前關于內質網與骨骼肌損傷的研究集中在運動性骨骼肌損傷，其在SMC 中的作用有待進一步研究。

5 內質網應激-自噬反應與SMC研究

內質網應激在短期內可以增強細胞應對刺激的能力并促進細胞存活，但持續的內質網應激會誘導炎性、自噬反應等發生［37］。內質網自噬主要以一種選擇性的、受體-蛋白介導的方式存在，哺乳動物以Ca2+穩態失衡與過度未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）的內質網應激為關鍵［41］。當內質網過度應激時，內質網鈣泵功能和結構受損，將啟動自噬途徑清除滯留的蛋白聚集體和受損內質網［42］。利用內質網應激激活物衣霉素（tunicamy?cin，TM）或毒胡蘿卜內酯（thapsigargin，TG）誘導成肌細胞劇烈內質網應激時，可以檢測到自噬通路的激活。研究表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可能介導了內質網應激對自噬的誘導作用，免疫熒光染色可以檢測到PKC 與自噬蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）陽性自噬體的共定位，阻斷PKC對TG誘導的內質網應激無影響，但可以抑制自噬［37］。

除了PKC 介導的內質網應激對自噬過程有誘導作用［43］，內質網應激和自噬之間還存在其他途徑。《Nature》報道FAM134B 作為一種受體蛋白，幫助內質網碎裂成可以輕易納入自噬體中的碎片，當內質網自噬啟動后，FAM134B 選擇性錨定受損內質網，幫助其碎裂成片段并與正常結構脫離，隨即招募自噬蛋白LC3，形成自噬體［44］。

6 線粒體自噬與SMC研究

自噬是細胞通過自我降解異常細胞器或錯誤折疊蛋白，以更新并維持細胞內環境穩態［42，45］。羅翱等［46］研究發現，骨骼肌自噬相關因子表達，隨骨骼肌損傷與修復的變化而變化，推測骨骼肌急性鈍挫傷的修復速度可能與細胞自噬水平有關。

關于自噬在骨骼肌損傷與修復中的作用機制，除了內質網過度應激誘導，有關報道認為鈍挫傷誘發的局部組織供氧不足，促使大量的ROS 產生，低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）被激活［47］，導致線粒體膜外蛋白BNIP3、NIX 的表達升高。過表達的BNIP3 和NIX 誘發線粒體自噬，通過介導線粒體內溶酶體蛋白，消除氧化的線粒體蛋白，維持線粒體的穩定［48］，從而達到促進鈍挫傷修復目的［49-50］。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein ki?nase，AMPK）是近年來能量代謝研究的熱點，在能量產生不足或機體組織缺氧狀態下可被激活。SMC后肌組織被破壞，炎細胞浸潤，線粒體腫脹等病理改變，導致組織缺血缺氧，ATP 生長障礙，進而激活AMPK信號通路。溫含等［51］研究證實，骨骼肌鈍挫傷后AMPKa2表達升高。被激活的AMPK 可通過Atg1和ULK 途徑促進線粒體自噬［52］。相關研究表明，AMPK信號通路激活對SMC后的修復作用主要體現在促進肌細胞能力代謝方面，具體表現為促進線粒體合成［53］，增加肌纖維對糖攝?。?4］，并通過抑制mTOR蛋白，減少蛋白質合成，節約ATP消耗［55］。

7 小 結

雖然國內外對SMC 機制沒有定論，但是目前研究的重點聚集在肌衛星細胞，以及調控肌衛星細胞成肌分化的相關信號通路：RBP-Jκ/Notch信號、Wnt信號、P13K/Akt/mTOR 信號通路，這3條信號通路將有望成為臨床研究治療SMC 的作用靶點，有助于探討SMC 的治療作用機制。但值得注意的是，Wnt信號通路在成熟骨骼肌再生過程中的作用存在爭議，激活Wnt 信號通路是否有利于骨骼肌損傷與修復需要更多的研究來進行論證。

同時，血管新生因子、Ca2+介導的細胞膜修復、內質網應激、自噬（內質網和線粒體）也是研究的重點和熱點。影響骨骼肌損傷與修復的因素錯綜復雜，雖然P13K/Akt/mTOR信號是誘導自噬的通路之一［56］。但隨著研究的進展，近年來認為內質網應激是一種新型的誘導自噬激活途徑［57］。關于自噬在骨骼肌損傷修復中的作用機制，除了內質網過度應激誘導，有關報道認為鈍挫傷誘發的局部組織供氧不足，促使大量的ROS 產生或AMPK 信號通路的激活，均可誘導線粒體自噬維持線粒體的穩定，減少能量消耗，從而有利于促進鈍挫傷修復。雖然骨骼肌鈍挫傷的損傷修復的機制錯綜復雜，但上述學說之間有交叉之處。因此對于骨骼肌鈍挫傷的損傷修復機制研究可以圍繞以上學說進一步深入研究，以明確不同學說在骨骼肌損傷修復的不同階段如何發揮協同作用。