腐植酸的組成結構及其對作物根系調控的研究進展

周麗平，袁 亮，趙秉強*，李燕婷，張水勤

（1 天津市農業科學院農業資源與環境研究所，天津 300192；2 農業農村部植物營養與肥料重點實驗室/中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

腐植酸是動植物遺骸經過微生物的分解和轉化，以及地球化學、物理的一系列變化過程而形成積累起來的一類具有多種官能團的大分子有機弱酸混合物[1–2]。它能夠調控肥料的釋放和轉化，改善肥料理化性狀，刺激根系生長，提高根系對養分的吸收，進而提高作物產量和肥料利用率，減少施肥帶來的環境壓力。因此，腐植酸被用于制備綠色高效肥料新產品，以更好地調控根系的吸收功能，大幅度提高肥料利用率[3–5]。

腐植酸的生物活性與其結構息息相關，不同結構的腐植酸對植物生長的原生代謝和次生代謝過程調控效果不同。從堆肥材料中分離出的腐植酸富含羧基基團和疏水結構[6]，從蚯蚓糞中提取的腐殖質疏水性結構較為明顯[7]，風化煤中提取的腐植酸能增加玉米根系碳水化合物、蛋白質、多肽和氨基酸類物質的含量，減少其在莖中的積累[8]。施用純化的褐煤腐植酸可改變黃瓜主要生理根對缺鐵響應的轉錄調控[9]，腐植酸與根細胞壁相互作用可以降低根際的導水率[10]。Piccolo等[11]、Nardi等[12–13]認為聚合程度低、分子量小的腐植酸可增加玉米根表面積，提高玉米根系H+-ATP酶和H+-PPase酶的活力，而Canellas等[14]、Zandonadi等[15]認為聚合程度高、分子量大的腐植酸有助于提高玉米根系H+-ATP酶和H+-PPase酶的活力。因此，需要進一步深入研究腐植酸的結構與其生物活性之間的關系。

1 腐植酸的組成與結構

1.1 腐植酸的組成

腐植酸因其來源、形成方式的不同，可以分為天然腐植酸和人工腐植酸。天然腐植酸包括土壤腐植酸、水體腐植酸、煤類腐植酸；人工腐植酸包括生物發酵腐植酸、化學合成腐植酸和氧化再生腐植酸。以來源方式又可分為原生腐植酸、再生腐植酸和合成腐植酸[16]。腐植酸主要由C、H、O、N和S等元素構成，C和O兩種元素的含量范圍分別為42%～67%和25%～45%，遠高于H、N和S。腐植酸還含有少量的Ca、Mg、Fe和Si等元素[17]，腐植酸的元素組成與其形成時的環境條件(尤其是前體)關系很大[18]。腐植酸的元素摩爾比可表征其芳香度和氧化程度，C/H值越大，芳香度越高，不飽和度越高；O/C值越大，氧化程度越高。泥炭腐植酸的氧化度不高，但是其縮合度卻比豬糞腐植酸高得多。腐植酸是多價酚型芳香族化合物與氮化合物的縮聚物，由幾百種有機化合物組成[19]，其裂解產物主要有烷烴類、飽和醇類、非飽和線性醇類和吡啶類等[20–21]，這些化合物來源于碳水化合物、脂類、蛋白質和木質素等。腐植酸的主要成分是芳香酸和甲基化酚，芳香衍生物主要是苯二羧酸二甲基酯，是由木質素的側鏈經微生物氧化降解生成，甲基化酚主要來源于木質素[22–24]。腐植酸形成機制基于3個主要理論[17]，分別為氨基糖縮合理論、多酚理論和木質素理論(圖1)。在腐植酸形成過程中，植物殘體經過微生物的分解可以產生糖類、氨基化合物、多酚、木質素降解物等，這些物質通過物理和化學鍵相互結合形成腐殖物質，因此，腐植酸裂解產物中才會有較多的含氮化合物(主要是雜環和脂環化合物)、脂肪族化合物(主要是烴類、一元羧酸和二元羧酸的甲基化酯)、木質素產物(主要是甲基化酚)、碳水化合物(糖類)和芳香族化合物(腐植酸的基本組成構架，由羧基、羥基等連接在苯環上形成)等[20]。此外，腐植酸的熱解曲線也顯示出腐植酸的物質組成。當高溫處理時，腐植酸產生因多糖降解、酸基脫羧和脂肪醇脫水，氮化合物和長鏈碳氫化合物的分解，芳香族結構的燃燒和C—C鍵解離的放熱峰[25]。

圖1 腐殖物質形成機制[17]Fig. 1 Mechanisms for the formation of humic substances

1.2 腐植酸的結構

腐植酸的結構復雜、組成多樣，是不均一且多分散混合物，因此，無法準確表征其結構，只能采用化學分析、光譜分析和物理學分析等來描述其主要結構特征[21]。研究腐植酸結構的方法有破壞性和非破壞性兩類。破壞性方法主要有化學滴定法、紫外-可見光譜法、熱解、降解和快速原子轟擊質譜、凝膠滲透色譜法、尺寸排阻色譜法、X射線散射法、超速離心法、氣相滲透壓法、冰點降低法和質譜法[21]。化學滴定法可用于測定腐植酸的含氧官能團和絮凝限度，紫外–可見光譜法可用于測定腐植酸的E4/E6值，熱解、降解和快速原子轟擊質譜可用于測定腐植酸的物質組成，熱解過程中可加入四甲基氫氧化銨以增加對腐植酸極性基團的保護[18]，凝膠滲透色譜法、尺寸排阻色譜法、X射線散射法、超速離心法、氣相滲透壓法、冰點降低法和質譜法用于測定腐植酸的相對分子質量，而凝膠滲透色譜法和尺寸排阻色譜法用于測定腐植酸的表觀相對分子質量。非破壞性方法主要有核磁共振、漫反射傅里葉變換紅外光譜、表面加強拉曼光譜、X射線吸收近邊結構和X射線吸收光譜，通過這些方法可以分析腐植酸的碳構架和氫構架(圖2)。

圖2 Stevenson腐植酸模型Fig. 2 Humic acid model by Stevenson

腐植酸官能團含量是其結構特征的重要體現。腐植酸的羧基/醇羥基值(A/B)反映腐殖物質氧化度和芳香度的高低，A/B越低，氧化度越低，芳香度越高[18]。一般來講，隨著腐殖化進程的推進，羧基、甲氧基和羰基含量下降，酚羥基含量增加[26]。E4/E6值越大，芳構化程度越低，相對分子質量越小。腐植酸結構受其來源和形成前體的影響較大。采用核磁共振、漫反射傅里葉變換紅外光譜、表面加強拉曼光譜、X射線吸收近邊結構和X射線吸收光譜法研究發現，各類來源腐植酸中均含有芳香碳、羧基碳、羰基碳和羥基碳等結構，但其吸收強度不同[27–33]。與土壤和水體中的腐植酸相比，煤炭腐植酸的結構更復雜，含更多縮合芳香結構[21]。褐煤腐植酸的骨架是由2～5個環縮合而成的稠環芳核，通過烷烴橋鍵、醚鍵、羰基等隨機鏈接組成，分子間還通過金屬離子橋和氫鍵等締合成超分子結構[21]。目前，腐植酸的典型結構是Stevenson的腐植酸模型[17]。

1.3 化學改性對腐植酸組成和結構的影響

化學改性可以改變腐植酸的功能組成，常用的化學改性方法有氧化、磺化、胺化、微波活化等，經過磺化、胺化、共聚等化學改性后的腐植酸較改性前的降濾失性能有較大改善[34]，而氧化是增加腐植酸含氧官能團數量的重要方式。目前常用的腐植酸氧化方法有過氧化氫氧化法[35–36]、堿性CuO-NaOH氧化法[37–38]、堿性高錳酸鉀氧化法[39–41]、硝酸氧化法[42]和次氯酸鈉氧化法等。高錳酸鉀氧化可以增加腐植酸中烷基碳和芳香碳的含量，降低芳香度[38–41]。過氧化氫氧化可以增加腐植酸中羰基、羧基和氧烷基的含量，減少芳香碳、氧芳香碳和烷基的含量[43]。過氧化氫法氧化煤腐植酸的機理：首先，煤中的弱―C―O―鍵斷裂，產生CO2和大量水溶性有機化合物，同時在化合物的稠合芳環周圍形成許多羧基；然后，具有羧基的芳族環逐漸分解以產生小分子酸，一些芳環也會氧化生成小分子酸；隨著氧化的進行，氧化煤殘渣中脂肪族化合物和羧基增加[35–36]。通過堿性高錳酸鉀氧化甲基化腐殖物質鑒定的主要產物為苯羧酸、酚酸和脂肪族二羧酸，苯羧酸包括一系列2-、3-和4-苯羧酸，這主要是由脂族側鏈的氧化形成的[39–41]，高錳酸鉀酸性氧化和高錳酸鉀堿性氧化均可以增加腐植酸的H/C值[7]。腐植酸經硝酸氧化后可以獲得各種脂肪族二羧酸、苯羧酸、羥基苯甲酸和硝基化合物等[42]。

2 腐植酸對植物生長的調控

2.1 腐植酸對植物生長的影響

腐植酸可促進植物生長，增加植物地上部和根系的干物質重[44–47]。Rose 等[48]采用 Meta 分析方法研究了腐殖質對植物生長的影響，結果發現，施用腐植酸后，植物地上部生物量和根干重均顯著增加，但其增加幅度因腐植酸的來源、濃度、植物生長環境、植物類型和腐植酸的施用方式而異。來自于堆肥的腐植酸促進地上部生長的效果最好，來自于土壤的腐植酸次之，來自于泥炭的腐植酸表現最差。當植物受到鹽度、重金屬毒性、養分缺乏等脅迫時，高腐植酸施用量可更有效地結合過量的陽離子來減輕重金屬或鹽度脅迫。植物類型不同腐植酸的效果不同，腐植酸對單子葉植物的促生效果最好，對雙子葉植物次之，對木本植物則有抑制作用。對植物地下部而言，來源于家畜糞便堆肥的腐植酸表現最好，而來源于土壤的腐植酸表現有所下降。對不同的植物栽培方式而言，腐植酸對土培植物的表現最好，對水培的植物表現最差，對植物類型而言，腐植酸對雙子葉植物的根生長影響最顯著，對木本植物的根沒有抑制作用，但表現不如對草本植物的效果[49–50]。

腐植酸對植物生長的影響與其結構特性關系密切。Muscolo等[50]綜述了腐殖物質與植物生長發育之間的關系，結果發現，蚯蚓糞中存在植物生長調節物質，可促進植物生長，從蚯蚓糞中提取的低分子量級分含有特定的生物活性物質，更能促進擬南芥和玉米幼苗根系的生長[51]。還有研究表明，低分子量腐植酸中含有較高含量的羧基和芳香族碳，因此具有較高的生物活性[52]。對于從風化煤中提取的腐植酸，其分子構象能促進黃瓜莖枝生長，提高H+-ATP酶活性和硝酸鹽濃度[53]，因此，繼續深入研究腐植酸的結構對植物生長調控的影響意義重大。

腐植酸含有很多活性官能團，具有較高的物理、化學和生物活性[54–63]。小分子腐植酸被植物體吸收利用后，以類激素的方式調節植物體內的新陳代謝過程。Nardi等[13]研究發現，小分子量腐植酸中較高含量的羧基碳和類赤霉素活性使其能增加玉米對硝酸鹽的吸收。

2.2 腐植酸活性功能團對養分的有效性有雙向調控

腐植酸中的羧基、羰基和酚羥基等官能團，具有較強的離子交換和吸附能力，施入土壤后，既可以固持土壤和肥料中過多的養分，又可以在其含量低時釋放出來，因而可提高植物體對大、中、微量元素的利用效率[54]。將腐植酸直接添加在尿素中，腐植酸的各活性含氧官能團均能與尿素發生化學反應，并形成穩定性較高的化學鍵[55]，進而調節氮素的穩定釋放，提高作物對氮素的吸收[58,64–65]。而且腐植酸與化學氮肥可發生反應形成腐植酸銨，從而減少氮素揮發和淋失[66]，在土壤中還可以通過配位作用、離子交換吸附作用、競爭吸附位點作用和增加磷酸鹽的移動等方式來減少土壤對有效磷的固定。腐植酸的酸性功能團可吸附和貯存鉀離子，防止土壤鉀素的流失，同時減少黏土礦物對鉀的固定。腐植酸化學螯合微肥可以增加作物對微量元素的吸收利用[3–5]。因此，腐植酸在調節植物養分吸收、增加土壤養分有效性和提高肥料利用率方面作用顯著。

2.3 腐植酸對植物原生代謝和次生代謝的影響

腐植酸可以影響植物的原生代謝和次生代謝過程。植物的原生代謝是指植物生存、生長和繁殖所必需的基本生物化學過程[52,60]。腐植酸可通過不同的方式來影響糖酵解和三羧酸循環中諸如磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、蘋果酸脫氫酶和葡萄糖激酶等酶的活性，其影響方式主要取決于腐植酸的分子量大小、分子特性和濃度[50]。腐殖物質的低分子量級分因具有較多的官能團，尤其是含有較多的羧基和酚基，其在改善植物新陳代謝中發揮重要作用。具有最少剛性分子構象的最小分子量級分，木質素部分含量最低，其他非木質素芳香族化合物含量最大，且具有最強的生物效應[67]。Zandonadi等[15]從不同土壤物質中分離腐植酸，發現縮合的腐植酸化學結構因呈現出類生長素活性而更有利于刺激玉米根系生長、側根和液泡膜H+-ATP酶的增殖。

植物的次生代謝可定義為不直接參與植物生長發育的一系列有機化合物的代謝過程，其主要功能是保護植物抵御食草動物和病原體對植物的傷害。次生代謝的物質主要有萜烯類化合物、酚類化合物和含氮化合物三類[52,68]。噴施含腐植酸水溶肥、黃腐酸鉀和黃腐酸精華液的葉面肥均可以提高檸檬次生代謝產物揮發油、總黃酮和總酚的含量，可以不同程度地改善檸檬的品質、口感及功能活性[69]。魏世平等[70]研究發現，腐植酸鉀–苯并噻二唑能增加過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶的活性和酚的含量，從而增加防御能力，而苯丙氨酸解氨酶是一種苯丙類化合物的關鍵酶，會導致水楊酸、植物抗毒素和類木質素聚合物等植物次生代謝物的產生。

3 腐植酸對作物根系生長的調控

根系作為腐植酸作用于植物體最先接觸的器官，其對腐植酸的響應是促進植物生長的最初動力[71–73]。腐植酸可通過影響根系形態、根系養分吸收、根系基因表達等來影響根系的生長發育。腐植酸對作物根系形態的影響是其對根系生長影響的直觀反應。前人研究了從不同來源獲得的腐植酸影響根系增長、形態和根構型的能力。腐植酸對根系形態的影響大體分為兩部分：1)對單個根形態的影響。腐植酸可通過增加細胞數量，改變細胞大小和細胞類型，增加側根和吸收型毛孔的數量等來促進根系生長[15, 74–76]。有研究認為，腐植酸刺激植物生長的機制之一是通過誘導質膜H+-ATP酶的增加，使原生質體酸化，從而使細胞壁松動，促進細胞伸長。2)對整株根形態的影響。腐植酸可以通過增加主次生根密度和分支數，改變根粗等來改善根構型[77–79]，繼而從改善整株根的形態上來影響根系生長。腐植酸可以提高根系H+-ATP酶的活性，增加離子跨膜運輸動力的電化學質子梯度，促進離子和養分的吸收。Chen等[80]揭示了腐殖質對根系生長發育和微量元素攝取的刺激作用。特別是Varanini等[81]的研究表明，在加入腐植酸的鹽水培養基中，番茄對礦物質營養攝取量顯著增加，這可能是由于根細胞膜的滲透性增加所致。腐植酸對根系生長及其對養分吸收的促進作用與其對作物根系基因表達的影響密切相關[82–85]。腐植酸具有類似生長素和赤霉素的生理功能，這兩類激素是控制根系發生和植物生長的正向調控因子[86–82]，GRAS1是響應生長素[88]和赤霉素[89]的關鍵轉錄因子，它參與了這兩類激素誘導的細胞分裂和膨大進程，具有促進生長和根系發生的作用，而一些低分子量的腐植酸(黃腐酸)能促進GRAS1的表達，這可能與黃腐酸中含有生長素或赤霉素類似物有關[89]。黃腐酸還可以刺激植物根系分泌質膜H+-ATP酶，這種作用歸因于電位的耗散和膜通透性的增加[90]，或通過某種翻譯機制進行酶調節[13,77]。

有研究表明，低分子量的腐植酸具有更好的改善根構造、促進根系生長發育的功能，并可以通過生長素信號傳導影響根系的生理代謝[12]。Canellas等[79]研究表明，從蚯蚓糞中提取的腐植酸的上層結構中的異質和移動分子更有利于增加擬南芥和玉米的側根數和根毛密度。Dobbss等[7]、Canellas等[91]研究發現，從蚯蚓糞中提取的腐植酸的疏水性指數與玉米、擬南芥和土豆中的側根數量呈正相關。根系的伸長區和分生區包括小而密的分生組織細胞，這些細胞具有連續的代謝活性，易受側根形成的影響。相關研究還觀察到腐植酸處理對側根出現部位的過度誘導，證明了腐植酸對側根的出現有顯著影響，這是因為腐植酸中含有類生長素的外源物質，從而促進側根發生，改善根系形態。生長素是在植物中發現的第一種激素，是構成植物體最重要的形態發生化合物之一，生長素信號觸發周期細胞群重新進入細胞周期并建立側根有絲分裂位點[92]。生長素的感知和信號通路也是完成生長素生物學功能的必要條件[93]。而側根的生長發育除了受內源生長素的影響，還受外源類生長素類物質的影響。此外，Loffredo等[94]的研究結果表明，疏水性更強、縮合程度更高、富含更多C、H、N和酚類的腐植酸促進胡椒草根系生長的效果更好。

從蚯蚓糞中提取的腐植酸能夠增加玉米、擬南芥和土豆的側根數，提高H+-ATP酶的活性，其效果與腐植酸的疏水性指數呈正相關[78,92]。從城市廢棄物中提取的腐植酸能夠促進玉米側根的生長，并提高玉米根系H+-ATP酶的活性，該作用效果主要歸因于腐植酸含有較多的羧基并具有較強的疏水特性[6]。從土壤、蚯蚓糞和污泥中提取的腐植酸能夠增加玉米有絲分裂位點、根鮮重、側根數、根表面積和主根長，提高玉米H+-ATP酶的活性，并且聚合程度低、分子量小的腐植酸具有更好的效果[11,13–14,52]。也有研究表明，從土壤中提取的腐植酸能夠增加玉米側根數，提高玉米根系H+-ATP酶的活性，并且聚合程度高、分子量大的腐植酸的作用效果更好[14–15]。從土壤中提取的腐植酸在高濃度下，能夠更好地促進燕麥對K+和SO42–的吸收[95]。從泥炭、褐煤中提取的腐植酸自組裝超分子結構中的生物活性分子能夠促進小麥和玉米根系的生長發育[96–97]。因此，腐植酸的結構對其功能影響較大，但是其具體作用機制未有定論、仍待研究，在后期研究中，需根據不同的作物需求進行選擇。

4 展望

腐植酸的結構特征研究是研究其對作物生長發育尤其是根系生長發育調控機制的重要基礎。雖然在腐植酸結構的表征技術、調控作物生長發育的機理研究等方面取得了重要進展，但以下幾個方面仍值得進一步探討。目前常用的腐植酸結構的研究方法存在不同程度地改變腐植酸功能團類型和數量的問題，需加強核磁、遠紅外等非破壞性方法來校正已有方法所得的結果，對腐植酸做更為精準的表征。加強腐植酸次生產品對作物生長發育調控的機理研究，為特定生長環境和植物類型制備專用的腐植酸提供理論依據和技術支持。腐植酸具有一定的類激素活性，其作用機理到底是腐植酸本身含有的激素還是對植物體的刺激作用誘導產生的植物激素，又或者是腐植酸介導了植物體內的信號傳導過程，從而改變了植物生長微環境的激素水平仍不確定，值得進一步研究。