普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌發酵產物促進平邑甜茶幼苗生長和連作土壤生物環境改善

張 榮，黃君霞，段亞楠，王海燕，王 玫，陳學森，沈 向，尹承苗，毛志泉

（作物生物學國家重點試驗室/山東農業大學園藝科學與工程學院，山東泰安 271018）

我國已成為名副其實的蘋果生產大國[1]。隨著蘋果產業的不斷發展，尤其是蘋果新品種的不斷更新以及矮化密植技術的推廣，蘋果連作障礙又稱蘋果再植病，成為我國蘋果產區重茬栽培時普遍發生的一種綜合病[2]，具體表現為再植蘋果幼樹的根系不健康、生長慢、植株矮小、病蟲害加重，嚴重時導致整樹死亡[3]，對蘋果產業的可持續發展造成非常不利影響[4]。多數研究認為，連作障礙的發生與土壤微生物群落結構失衡有密切聯系，最顯著的表現為連作土壤中有害真菌數量的增加，有益細菌數量減少[3,5–7]。大量研究表明，鐮孢屬(Fusarium)真菌是蘋果連作障礙中最常見的有害菌，在中國、南非、意大利等蘋果產區普遍存在且生命力強[6,8]。徐文鳳[9]和王功帥[10]分別從環渤海灣蘋果產區的老蘋果園以及連作蘋果園土壤中分離到大量鐮孢菌，通過致病性試驗發現其對蘋果砧木平邑甜茶幼苗有強致病性。因此，抑制病原菌數量，改善土壤的微生物群落結構對防控連作障礙具有重要意義[11–12]。

在土壤中引入生防菌來改善微生物環境，對蘋果連作障礙進行生物防治是一種綠色環保的方式。在蘋果連作障礙研究中，生防菌大多從健康蘋果樹根系及根際土壤中分離獲得，細菌多為枯草芽胞桿菌和假單胞桿菌，真菌有叢枝菌根真菌、木霉和青霉[13]，放線菌以鏈霉屬為主[14–15]。混合微生物防治是一種生物防治的新思路新熱點[16]，前人研究表明生防菌的混合使用比單一使用效果更好。Hammad等[17]曾報道用放線菌和細菌聯合可有效地防治黃瓜枯萎病。Latha等[18]研究表明綠色木霉 (Trichoderma viride)、熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的組合使用在防治土傳病害的根腐病和莖腐病方面效果顯著。

劉錦霞等[19]研究表明互不拮抗的生防菌 2種和土壤改良菌 3種，以一定比例有效結合于有機介質上制成多效微生物復合固體制劑，能夠有效改良干旱區連作馬鈴薯土壤的生態環境，防控病害，促進植株生長，并提高產量和品質。李恩琛等[20]研究表明復合生防細菌發酵液對蘋果主要病原菌抑制作用優于單一菌株，并且具有較好的穩定性。因此，利用多種微生物防治蘋果連作障礙有巨大的潛力，加上發酵產物制作工藝簡單，生產成本低，使用混合微生物發酵產物進行生物防治具有廣闊的市場前景。

青霉屬真菌和乳桿菌屬細菌作為生防菌使用的研究較少[21]，蘇前富等[22]研究表明微黃青霉ZF1 可用于防治玉米禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病。有研究表明，乳桿菌屬(Lactobacillus)不僅可以抑制灰霉屬和鐮孢屬等真菌菌絲體和孢子的生長，還可以降解真菌毒素[23–24]。本研究將普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌進行發酵，以蘋果常用砧木平邑甜茶為試材，在盆栽試驗條件下研究普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌及其混合發酵產物對平邑甜茶幼苗和連作土壤環境的影響，探討發酵產物對蘋果連作障礙的防控效果，為生物防控蘋果連作障礙提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽試驗所用土壤取自山東省泰安市滿莊鎮 32年生的蘋果園，從距離蘋果樹干80 cm、深 10—40 cm 的區域，多點隨機取土，混勻。土壤質地為砂土，有機質含量為8.3 g/kg、硝態氮含量為11.76 mg/kg、銨態氮含量為5.76 mg/kg、速效鉀含量為116.6 mg/kg、速效磷含量為 10.4 mg/kg、土壤 pH 5.66。

本研究供試材料為蘋果常用砧木平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)。2019年 1 月將用水浸泡過的種子與濕潤細沙混勻，于 4℃左右層積處理 40天，待種子萌動露白后在育苗盤中播種育苗。于四月中旬選取有6片真葉且長勢整齊無病蟲害的幼苗移栽到外徑 29 cm、內徑 25 cm、高 18cm 的泥瓦盆中進行盆栽試驗，每盆兩株幼苗，統一肥水管理。

普通青霉 D12 (Penicillium commune D12)由蘋果重茬與微生物實驗室提供，其生物保藏號為CGMCC No. 11112。D12在PDA固體培養基接種活化7天，接種至PDA液體培養基，搖床125 r/min 25℃培養5天，即得D12發酵液，活菌數≥2×109CFU/mL，8層紗網過濾得上清液即D12發酵產物，于4℃保存。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)購自中國食品發酵工業研究院有限公司，保藏編號為CICC 6118。羅伊氏乳桿菌活化接入改良MRS培養基中，37℃條件下培養5天，即得羅伊氏乳桿菌發酵液，活菌數≥3×109CFU/mL，羅伊氏乳桿菌發酵液混勻至無沉淀，8000 r/min離心10 min，取上清液即得羅伊氏乳桿菌發酵產物，于4℃保存。

1.2 試驗設計

試驗設置4個處理：連作土壤對照(CK)、施用D12發酵產物 (R1)、施用羅伊氏乳桿菌發酵產物(R2)、兩個發酵產物1∶1混合施用 (R3)，每個處理20個重復。6月中旬按每盆80 mL施入相應的發酵產物，之后進行正常的肥水管理。各處理在施加相應發酵產物后第38天(7月23日)、69天(8月23日)、100天(9月23日)取樣并測定相關指標，每個處理隨機取3盆作為3個重復。取土樣時，去除表層土，取根圍土，混勻，過0.85 mm篩，制成3份平行樣品，一份自然風干，用于測定土壤酶活性；一份用于測定微生物數量；一份存于 –80℃冰箱，用于提取DNA。取植株樣品時，將根部土壤輕輕抖落，用清水沖洗根部，迅速取白根，放入液氮中，用于測定根系保護性酶活性。將植株完整帶回，測定根系呼吸速率、株高、地徑、鮮重，烘干至恒重后，測定干重。

1.3 測定指標

1.3.1 生物量使用卷尺、游標卡尺、天平測量株高、地徑、鮮重及干重。

1.3.2 根系呼吸速率 (活力)參照毛志泉等[25]的方法使用Oxy-Lab 氧電極自動測定系統測定根系呼吸速率。

1.3.3 土壤酶活性脲酶活性測定采用比色法，過氧化氫酶測定采用滴定法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用比色法[26]。

1.3.4 根系保護性酶活性和根系丙二醛含量超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑(NBT)法，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法，過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法，丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[27]。

1.3.5 土壤中可培養細菌真菌數量細菌、真菌數量的測定采用稀釋平板培養計數法[28]。細菌用LB培養基培養1天后計數，真菌用PDA培養基培養3天后計數。

1.3.6 土壤微生物測定從處理后第100天的土壤樣品中取 0.25 g，用 MIO-BIO Power Soil DNA Isolation Kit土壤 DNA試劑盒按照試劑盒說明書所述步驟提取和純化土壤微生物DNA。用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進行檢測，檢測合格后進行雙向測序，用真菌 ITS 區通用引物 ITS1-F (5′?CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA?3′) 和 ITS2-R(5′?GCTGCGTTCTTCATCGATGC?3′) 進行 PCR 擴增，設計目標區域和帶有 “ 5′Miseq 接頭-barcode-測序引物-特異引物-3′ ”的融合引物，并采用兩步 PCR擴增的方法構建文庫。用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用 AXYGEN 公司 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收PCR產物。之后用FTC-3000TM real-time PCR 儀進行定量，將樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備，使用Miseq測序儀將文庫進行測序。

1.4 數據分析

根據 Barcode 序列和 PCR 擴增產物序列從原始序列中分出各樣品數據，對其進行拼接及質控過濾，獲得優化序列。利用軟件USEARCH和mothur以 97%的一致性將拼接好的序列聚類為OTU。利用軟件 mothur和QIIME對數據進行后續分析，利用R語言繪圖。試驗數據采用WPS 2019進行計算和作圖，采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和差異顯著性檢驗(鄧肯氏法，α = 0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同發酵產物對平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表1可以看出，施用普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌發酵產物后促進了平邑甜茶幼苗的生長，具體表現為R3>R1>R2>CK。發酵產物混合施用處理(R3)在促進平邑甜茶幼苗生長方面效果顯著，其幼苗的株高、地徑、鮮重、干重與連作對照相比均差異顯著。施用微生物發酵產物后第100天，R1處理的幼苗株高、地徑、鮮重、干重與對照相比分別增加了3.9%、14.78%、23.28%、18.96%；R2處理幼苗的地徑、鮮重與干重與對照相比分別增加了14.36%、12.57%、13.75%；R3處理幼苗的株高、地徑、鮮重、干重與對照相比分別增加了7.7%、17.4%、50.82%、37.5%。

表1 施用發酵產物后不同天數平邑甜茶幼苗的生物量Table 1 Biomass of Malus hupehensis Rehd. seedlings in different days after application of fermentation products

2.2 不同發酵產物對平邑甜茶幼苗根系呼吸速率的影響

由圖1可以看出，與連作對照相比，施加發酵產物的3個處理均促進了平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率。第69天，R1、R2和R3處理差異不大，第38天和第100天R3處理平邑甜茶幼苗根系呼吸速率最高，與對照相比分別增加了19.20%、17.04%。

圖1 施用發酵產物后不同天數平邑甜茶幼苗根系呼吸速率Fig. 1 Root respiration rate of Malus hupehensis Rehd.seedlings in different days after application of fermentation products

2.3 不同發酵產物對土壤酶活性的影響

由表2可知，與對照相比，施用發酵產物后土壤酶活性均有不同程度的提高。土壤過氧化氫酶活性，在第38天各處理與連作對照相比無顯著差異；第69天差異顯著，R1和R2顯著高于CK，R3又顯著高于R1和R2；第100天R1顯著高于CK，R2和R3與CK差異不顯著。土壤蔗糖酶活性，在第38天各處理顯著高于連作對照。第38天脲酶活性和磷酸酶活性為R1和R3 處理顯著高于CK；第69天，脲酶活性R1、R2和R3各處理顯著高于CK，R1和R3 的磷酸酶活性顯著高于CK；第100天，各處理脲酶活性、磷酸酶活性和蔗糖酶活性顯著高于CK，其中R3處理與CK相比分別增加了66.67%、34.24%、25.49%。

表2 施用發酵產物后不同天數土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities in different days after application of fermentation products

2.4 不同發酵產物對平邑甜茶幼苗根系保護性酶活性和根系丙二醛含量的影響

由圖2可知，施用發酵產物后，平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性均有不同程度的提高，其中以混合發酵產物處理(R3)促進效果最好。第100天，R1處理的幼苗SOD、POD和CAT活性與連作對照相比分別增加了7.25%、79.61%、27.69%；R2處理的幼苗SOD和POD與連作對照相比分別增加了13.25%、60.81%； R3處理的幼苗的SOD、POD和CAT活性與連作對照相比分別增加了29.19%、92.62%、39.59%，丙二醛含量降低了23.40%。

圖2 施用發酵產物后不同天數平邑甜茶幼苗根系保護酶活性及丙二醛含量Fig. 2 SOD, POD, CAT activities, and MDA content in the roots of Malus hupehensis Rehd. seedling in different days after application of fermentation products

2.5 不同發酵產物對土壤中可培養微生物數量的影響

由表3可知，在施加發酵產物后，與連作對照(CK)相比，土壤中細菌數量顯著增加，真菌數量顯著降低。施用后第38天、69天和100天，普通青霉D12發酵產物處理(R1)土壤中細菌數量分別增加了38.18%、92.72%、94.20%，真菌數量分別降低了21.31%、29.63%、37.11%。羅伊氏乳桿菌發酵產物處理(R2)土壤中細菌數量分別增加了50.02%、59.79%、61.17%，真菌數量分別降低了40.44%、31.48%、28.06%。發酵產物混合處理(R3)土壤中細菌數量分別增加了39.48%、101.24%、81.56%，真菌數量分別降低了45.58%、32.09%、24.43%。

表3 施用不同發酵產物后不同天數土壤中的細菌和真菌數量Table 3 Population of bacteria and fungi in soils at different days after application of fermentation products

2.6 不同發酵產物對土壤微生物環境的影響

由圖3主坐標分析結果可以看出，沿PC1軸方向，對照與3個發酵產物處理明顯分開。沿PC2軸方向，單一發酵產物處理(R1、R2)與混合發酵產物處理(R3)明顯分開。PCoA分析結果進一步表明，施用發酵產物對連作土壤真菌群落影響較大，并且單一發酵產物處理(R1、R2)與混合發酵產物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響不同。

圖3 施用不同發酵產物后土壤真菌群落主坐標分析Fig. 3 Principal coordinate analysis of soil fungi communities after application of different fermentation products

由圖4聚類分析結果可以看出，連作對照(CK)單獨一個分支說明施入發酵產物后土壤微生物群落發生改變，單一發酵產物處理(R1、R2)與混合發酵產物處理(R3)又分別處在不同的分支，說明單一發酵產物處理(R1、R2)與混合發酵產物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響不同，與主坐標分析結果相一致。

在屬水平，各處理土壤樣品中相對豐度前8的屬為未知Unclassified、腐質霉屬Humicola、被孢霉屬Mortierella、鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria、普魯蘭久浩屬Guehomyces、枝孢菌屬Cladosporium、矛束孢屬Doratomyces(圖 4)。與對照相比，施加發酵產物后，土壤中腐質霉屬Humicola、被孢霉屬Mortierella的相對豐度增加，鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria的相對豐度降低(表4)。與對照相比，發酵產物混合處理(R3)的土壤中腐質霉屬Humicola、被孢霉屬Mortierella的相對豐度分別增加了73.61%、137.72%，鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria的相對豐度分別降低了52.48%、73.35%。

表4 施用不同發酵產物后土壤屬水平相對豐度(%)Table 4 Genus-level relative abundance of soils after application of different fermentation products

圖4 施用不同發酵產物后土壤聚類分析和屬水平相對豐度Fig. 4 Cluster analysis and genus-level relative abundance of soils after application of different fermentation products

2.7 平邑甜茶幼苗生理指標與土壤酶活性、可培養微生物數量和微生物群落的相關性

從圖5可以看出，脲酶活性與平邑甜茶幼苗生物量、根系呼吸速率和根系保護性酶活性極顯著正相關，細菌數量、磷酸酶和蔗糖酶活性與平邑甜茶幼苗生物量、根系呼吸速率和根系保護性酶活性顯著正相關。真菌數量、鐮孢菌屬、鏈格孢屬和枝孢菌屬與平邑甜茶生物量、根系呼吸速率和根系保護性酶活性顯著負相關，其中與平邑甜茶幼苗地徑極顯著負相關。被孢霉屬與平邑甜茶幼苗地徑顯著正相關。普魯蘭久浩屬與根系呼吸速率和根系過氧化物酶活性顯著正相關。

圖5 Pearson相關性分析熱圖Fig. 5 Heat map of Pearson correlation analysis

3 討論

連作障礙的發生是土壤養分失衡、有害微生物增加、土壤性質惡化、化感物質積累和微生物區系劣變等因素綜合作用的結果[29]，并且連作障礙最直觀的表現就是植株的生長受到抑制。連作不僅抑制蘋果根系生長，還影響根系功能。連作土壤中常含有酚酸類物質，當其積累到一定濃度會對作物根系造成逆境脅迫，根系中積累過多的自由基會導致膜脂過氧化，進而影響了膜的功能，降低了根系對營養元素和水分的吸收和運輸，進而影響根系活力，并且根系受影響程度高于地上部分[30–32]。本研究表明施用發酵產物能顯著地促進平邑甜茶幼苗的生長，其效果表現為：混合發酵產物處理(R3)>普通青霉D12發酵產物處理(R1)>羅伊氏乳桿菌發酵產物處理(R2)。并且施用發酵產物后平邑甜茶幼苗根系的呼吸速率顯著提高，抗氧化酶活性均有不同程度的提高，丙二醛含量降低，其中混合發酵產物處理效果最佳。叢韞喆等[16]研究發現擬康氏木霉和黑根霉混合發酵液對蘋果鏈格孢具有良好的抑菌效果，大田試驗表明其混合發酵液能夠提高蘋果葉片防御相關酶SOD、POD以及PAL的酶活力，進而有效防治蘋果斑點落葉病。周登博[33]研究表明，復合拮抗菌發酵液能降低香蕉枯萎病的發病率，且防病效果與酶活性呈正相關。可見發酵產物施入土壤后，改善了土壤環境，使得根系生長環境變得有利，根系呼吸速率、抗氧化酶活性提高，丙二醛含量降低，植株抗性增強，從而有利于植株的生長，有效地緩解了蘋果連作障礙。

土壤酶參與土壤中復雜多樣的生物化學反應，脲酶可催化水解土壤中的尿素產生氨，促使有機氮向植物有效態氮轉化，蔗糖酶通過水解蔗糖提高土壤可溶性營養物質含量，在土壤碳素循環過程中起關鍵作用。土壤磷酸酶主要是催化水解加速土壤有機磷轉化過程，而過氧化氫酶分解微生物體內的過氧化氫，減少毒害作用[34–35]。輕微的環境改變會使土壤酶活性發生變化，酶活性高低可以在一定程度上反映土壤養分轉化能力和土壤供應植物根系養分的潛在能力[36–38]。研究表明，隨連作年限增加，土壤中過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈顯著降低趨勢，而施用活的微生物菌劑能夠顯著提高連作土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性[39]。尤其是在熏蒸劑處理后，加入生物菌肥能夠使土壤酶活性趨于恢復和提升，從而快速形成更利于植物生長的土壤微環境[40]。本研究中，施入發酵產物后，連作土壤中的脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性均有不同程度的提高，這與劉麗英等[41]研究結果一致。與連作對照處理相比，普通青霉D12 發酵產物處理(R1)和發酵產物混合處理(R3)土壤中脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性在施用發酵產物后都顯著增加，而羅伊氏乳桿菌發酵產物處理(R2)后，蔗糖酶活性、脲酶和磷酸酶活性逐月依次提高。這可能是因為普通青霉D12 和羅伊氏乳桿菌發酵后發酵產物施入土壤發揮的作用不同所導致時效性的差異。其中發酵產物混合處理(R3)的效果最好，可能是因為普通青霉D12 和羅伊氏乳桿菌發酵產物混合后存在某些協同作用[42–44]。

諸多研究表明青霉菌生命力強，能夠通過競爭營養和空間來限制病原菌的生長[45–47]。并且青霉菌能夠產生豐富的次級代謝產物，包括聚酮類、生物堿類、萜類、大環內酯等，普遍具有抑菌活性[48]。有些青霉菌被證實具有一定的溶磷特性，且具有一定的促生效果[49]。乳酸菌作為公認的有益微生物，其代謝產生的活性物質被證明具有抗真菌活性，如有機酸、過氧化氫和細菌素，并且細菌素被認為是抗生素最有潛力的替代物，不同的乳酸菌所分泌的活性物質存在種類、數量和濃度上的差異，從而導致抑菌能力的差別[50–52]。現有研究報道，生防菌對蘋果連作障礙具有一定防治效果。生防菌通過調節土壤微生態環境對蘋果連作土壤中的病原菌有良好的抑制效果，能夠改善土壤微生物群落結構，并且促生效果明顯[53–57]。在本研究中，平邑甜茶幼苗地徑和根系呼吸速率與土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性極顯著正相關，而與鐮孢菌、鏈格孢菌和枝孢菌屬存在負相關關系。土壤酶來源于微生物，微生物群落結構對植物生長有重要影響。連作會導致土壤的微生物群落結構破壞，由于病原菌如鐮孢屬真菌對不同的土壤條件具有高度的適應性，所以一旦其成功地在土壤中定殖就會不斷積累，很難被徹底清除，土壤特性就會由細菌型向真菌型轉變[10,58]。鐮孢屬(Fusarium)侵染根部后，會誘導導管堵塞，阻礙水分通過木質部的運輸，導致蘋果幼苗光系統損傷，還會產生毒素損害植物組織[59]。由PCoA分析和聚類分析結果可知，施用發酵產物對連作土壤真菌群落影響較大，并且單一發酵產物處理(R1、R2)與混合發酵產物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響是不同的。連作土壤中可培養真菌數量顯著降低，可培養細菌數量顯著增加，鐮孢屬、鏈格孢屬、枝孢菌屬相對豐度降低，說明施入發酵產物100天中，連作土壤正逐步向有利的細菌型轉變，施用發酵產物可以改善連作土壤微生物群落結構，使其往有利的方向發展。

4 結論

在土壤中添加普通青霉D12 發酵產物、羅伊氏乳桿菌發酵產物及其混合發酵產物均促進平邑甜茶幼苗生長，增強根系活力，提高土壤酶和根系保護性酶活性，降低丙二醛含量，可培養真菌數量顯著降低，可培養細菌數量顯著增加，鐮孢屬相對豐度降低，改善土壤微生物群落結構，使其往有利的方向發展，其中以普通青霉D12 和羅伊氏乳桿菌混合發酵產物處理效果最佳，可作為防控蘋果連作障礙綠色有效的措施。