沉默miR-208a對急性心肌梗死大鼠心室重構的影響及機制研究

劉國星 杜見霞 劉秀紅 杜亞軍 但國梅 王浩 董振松

急性心肌梗死是一種由冠狀動脈急性、持續性供血、供氧不足而導致的心肌組織細胞壞死癥狀[1,2]。急性心肌梗死患者主要臨床表現為胸骨后持久、劇烈疼痛，對患者生活質量、身體健康造成嚴重的威脅[3,4]。據世衛組織統計數據顯示，老年人為急性心肌梗死的高發群體，近年來我國人口老齡化現象愈發嚴重，急性心肌梗死新增病例連年上升[5,6]。目前臨床醫學尚無特效的針對急性心肌梗死的藥物、治療手段，急性心肌梗死癥狀的發生發展對患者生命安全造成嚴重威脅，因此探究急性心肌梗死發病機制，尋找新的治療靶點，對急性心肌梗死的治療具有重要意義。本研究建立急性心肌梗死大鼠模型，靶向調控miR-208a表達，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由吉林大學動物實驗中心提供，年齡9～10個月，平均(9.5±0.4)個月；體重219～232 g，平均體重(226.1±5.2)g。在相對濕度45%～55%、溫度(24.1±2.2)℃的環境中喂養大鼠1周，光照12 h/d。本研究醫我院倫理委員會批準。主要試劑：兔抗大鼠miR-208a抗體(Hyclone公司)；兔抗小鼠Bcl-2抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Caspase-3、TGF-β1抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗體(BD公司)；小鼠抗兔過氧化脂質(LPO)、丙二醛(MDA)抗體(Sigma公司)；大鼠抗小鼠Smad2、Smad3抗體(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組:隨機選取10只大鼠作為正常組，不做任何處理。其余30只大鼠建立急性心肌梗死模型：麻醉干預后，使用剪刀將左側第3、4段肋間皮膚剪開，打開大鼠胸腔，使大鼠心臟組織暴露于術野之中。剪開心包膜后對冠狀動脈前支進行穿線結扎，之后清創縫合。對所有大鼠進行心電圖檢查，ST段上抬至弓背向上為建模成功。最終建模成功25只，將25只急性心肌梗死大鼠隨機分為沉默miR-208a組(n=9)以及模型組(n=8)、過表達miR-208a組(n=8)。過表達miR-208a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-208a，沉默miR-208a組大鼠尾部靜脈注射30mg/kg antagomiR-208a，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 心功能檢測:對大鼠麻醉處理后，左傾30°仰臥固定，剃毛后將超聲探頭置于左胸骨，與中線夾角20°，觀察記錄4組大鼠左心室舒張末期內徑(LVEDd)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期內徑(LVESd)水平。

1.2.3 標本制備:取4組大鼠尾部靜脈血2 ml,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環境中保存待檢。對各組大鼠進行麻醉處理后，斷頭法處死，取大鼠心臟，清洗后觀察外觀，之后固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規石蠟包埋及連續切片。

1.2.4 HE染色:首先將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的乙醇中各復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.5 心肌梗死面積、心肌細胞凋亡情況檢測:在1% TTC溶液中孵育大鼠心肌組織切片20 min(孵育環境：避光，溫度保持在37℃),使用BI-2000醫用圖像分析系統計算大鼠心肌梗死面積。使用TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡情況，計算心肌細胞凋亡指數，并進行組間比較。

1.2.6 miR-146a表達檢測:RT-PCR檢測miR-146a表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，設計引物序列，采用2-△△Ct方法計算miR-146a表達。

1.2.7 B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、果蠅MAD類似基因2(Smad2)、果蠅MAD類似基因3(Smad3)相對表達量檢測:蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3的表達：取150℃的Ripa裂解液,1.5℃ PMSF冰中孵育30 min,4℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3相對表達量行檢測。

1.2.8 免疫透射比濁法檢測GSH-Px、LPO、MDA水平:準備3個試管，記為標準管、測定管、空白管，均添加緩沖液350 μl，標準管加入20 μl GSH-Px、LPO、MDA標準液，測定管中加入20 μl血清，空白管中加入20 μl蒸餾水3個試管分別搖晃均勻，常溫環境靜置5～10 min后使用分光光度計進行比色，在500 nm波長處以空白管調零，記錄吸光度，計算血清GSH-Px、LPO、MDA水平。

2 結果

2.1 4組大鼠心臟外觀、心肌組織病理學觀察情況 正常組大鼠心臟外觀顏色較為紅潤，形態正常，病理切片中心肌組織細胞排列規則且緊密；模型組、過表達miR-208a組大鼠心室腔變大，且出現大面積的梗死區域，心肌組織細胞排列雜亂，出現較多膠原纖維；沉默miR-208a組大鼠心室腔擴大現象出現緩解，梗死區域明顯縮小，心肌組織細胞排列較為雜亂，炎性細胞減少。見圖1、2。

圖1 4組大鼠心臟外觀情況

圖2 4組大鼠心肌組織病理學圖片(HE×200)

2.2 4組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達較高，且過表達miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 4組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達比較

圖3 Bcl-2、Caspase-3表達Western blot圖；A 正常組；B 模型組；C 過表達miR-208a組；D 沉默miR-208a組

2.3 4組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平較高，且過表達miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平比較

2.4 4組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數較高，且過表達miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數比較

2.5 4組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較 與正常組大鼠相比，模型組、過表達miR-208a組大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達miR-208a組相比，沉默miR-208a組大鼠GSH-Px水平較高，LPO、MDA水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較

2.6 4組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達較高，且過表達miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 4組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達比較

圖4 TGF-β1、Smad2、Smad3表達Western blot圖;A 正常組；B 模型組；C 過表達miR-208a組；D 沉默miR-208a組

3 討論

急性心肌梗死為一種臨床較為常見的心內科疾病，會導致機體心肌組織壞死，嚴重威脅患者身體健康[7,8]。目前臨床較為常用的治療急性心肌梗死的手段包括藥物治療、介入治療、溶栓治療等，但是臨床療效并不理想，因此許多專家學者開始致力于急性心肌梗死臨床治療的研究[9,10]。目前為止，臨床醫學尚未將急性心肌梗死的發病機制研究透徹，許多專家學者通過分子生物學、基礎醫學等途徑對急性心肌梗死發病機制進行研究[11,12]。微小RNA(miRNA)在大多數生物中大量存在，miRNA與機體炎性反應、免疫狀態、微生物感染等多種病理學變化具有密切聯系。大量研究表明，miRNA的異常表達與心血管疾病的發生發展密切相關，miR-208a為miRNA家族的組成成員，在急性心肌梗死中表達出現明顯異常，但是關于調控miR-208a表達對急性心肌梗死干預效果的研究還鮮有報道[13,14]。

有研究表明，miR-208a作為miRNA家族的重要成員，在機體心臟組織病變中具有一定的特異性[15]。Bcl-2是線粒體細胞凋亡通路中的重要基因，其表達的變化與細胞凋亡密切相關[16]。Caspase-3作為caspase家族重要成員，與細胞凋亡密切相關[17]。有學者在研究中表示，急性心肌梗死癥狀的發生發展與心肌組織細胞凋亡密切相關，Bcl-2、Caspase-3的異常表達在其中發揮重要作用[15]。本研究結果顯示，與正常大鼠比較，急性心肌梗死大鼠miR-208a表達較高，說明miR-208a在急性心肌梗死中呈現異常高表達。本研究還發現急性心肌梗死大鼠Bcl-2、Caspase-3表達較高，沉默miR-208a表達的大鼠miR-208a表達下調，同時Bcl-2、Caspase-3表達表達也出現下調，出現這一研究結果的原因可能是沉默miR-208a表達能夠靶向調控Bcl-2、Caspase-3表達，從而起到抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織細胞凋亡的作用。

急性心肌梗死癥狀的發生發展會導致心室重構，對機體心功能造成嚴重的影響[18,19]。LVEDd、LVEDV、LVESd是常用的評價機體心功能的指標。本研究結果顯示，相比正常大鼠，急性心肌梗死大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平異常上升，說明急性心肌梗死大鼠伴隨著心室重構狀況，沉默miR-208a表達的大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平出現明顯的下降，說明沉默miR-208a表達能夠調控LVEDd、LVEDV、LVESd水平，改善大鼠心室重構狀況，對大鼠心功能的改善具有積極作用。

急性心肌梗死癥狀的發生發展伴隨著機體心肌組織氧化應激損傷[20,21]。減輕機體心肌組織氧化應激損傷對急性心肌梗死患者的臨床治療、預后改善具有重要意義。GSH-Px、LPO、MDA水平變化情況與機體抗氧化防御系統的失衡、氧化應激損傷嚴重程度密切相關。本研究結果顯示，相比正常大鼠，急性心肌梗死大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，說明急性心肌梗死的發生發展伴隨著氧化應激損傷；沉默miR-208a表達的大鼠GSH-Px水平上調，LPO、MDA水平下調，說明沉默miR-208a表達，能夠提升急性心肌梗死大鼠抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，從而發揮干預效果。

急性心肌梗死的發生發展通常伴隨著心肌纖維化，心肌纖維化嚴重程度與急性心肌梗死嚴重程度以及患者預后密切相關[22-24]。TGF-β/Smads信號通路相關蛋白與心肌纖維化關系密切。本研究結果顯示，急性心肌梗死大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達較高，沉默miR-208a表達后，急性心肌梗死大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達出現下調，說明沉默miR-208a表達能夠調控TGF-β/Smads通路蛋白，減輕急性心肌梗死大鼠心肌纖維化，從而起到心肌保護作用。

綜上所述，沉默急性心肌梗死大鼠miR-208a表達，能夠靶向調控Bcl-2、Caspase-3表達，抑制心肌細胞凋亡，改善大鼠心室重構，能夠減輕心肌組織氧化應激損傷以及心肌纖維化，為急性心肌梗死的臨床治療提供一定的參考依據。