國產(chǎn)豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)用于兔硬腦膜修復(fù)的效果及安全性

孫立旦,楊飛霞,張 迪,陳澤良,張志慧,李英俊,史利軍

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,沈陽 110866;2.北京通和立泰生物科技有限公司,北京 102609;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片是采用豬小腸黏膜下層組織為原料，經(jīng)過病毒滅活、脫細(xì)胞、成型、凍干等工藝制備的天然衍生生物材料，是一種非交聯(lián)型動物源性細(xì)胞外基質(zhì)材料［1］。大量臨床和基礎(chǔ)研究顯示，小腸黏膜下層含有膠原蛋白、彈性蛋白、黏多糖、蛋白多糖和生長因子，在損傷愈合中起著重要作用，可顯著治愈難以愈合或慢性傷口［2］。小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)材料具有天然特有的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成，能夠主動誘導(dǎo)組織再生，并具有良好的生物相容性、生物力學(xué)強(qiáng)度和低免疫原性，在體內(nèi)可完全降解，有良好的抗感染能力，可用于多種軟組織缺損的修復(fù)。

目前，非交聯(lián)型小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片材料產(chǎn)品已廣泛用于燒傷、慢性傷口、肛瘺、腹壁疝修復(fù)、硬腦膜修復(fù)等臨床領(lǐng)域［3］，但是脫細(xì)胞不徹底會造成免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，不同廠家生產(chǎn)的補(bǔ)片在工藝和材料成分上存在一定差異，故需要通過動物試驗(yàn)來驗(yàn)證和評價(jià)。本研究采用新西蘭白兔模型，通過前瞻性隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)評價(jià)國產(chǎn)豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)材料在硬腦膜修復(fù)中的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

48只普通級新西蘭白兔，體質(zhì)量（2.5±0.25）kg，購自北京隆安實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心［SCXK（京）2019-0006］。動物飼養(yǎng)于北京通和立泰生物科技有限公司［SYXK（京）2019-0016］，用標(biāo)準(zhǔn)化兔籠單籠飼養(yǎng)，每只每天分兩次飼喂其體質(zhì)量5%的飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)），自由飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)操作均符合北京通和立泰生物科技有限公司動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會審批要求（IACUC 2019021）。

1.1.2 主要材料與試劑

供試品名稱為脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層基質(zhì)（供試品號為AN2019021），為北京博輝瑞進(jìn)生物科技有限公司贈送，批號為20181202，規(guī)格為7 cm×10 cm。對照品名稱為生物硬腦膜修補(bǔ)片購自美國Cook Biotech Incorporated公司，批號為LB838536，規(guī)格為4 cm×7 cm。3%戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司（批號P3761，規(guī)格25 g，CAS編號57-33-0）；陸眠寧Ⅱ購自吉林省華牧動物保健品有限公司（批號P20150402）；氯化鉀購自黑龍江省北安市飛龍動物藥廠（批號20181208）；氨芐西林（批號180701）、慶大霉素（批號180605）和青霉素（批號180401）均購自華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司；蘇木精染液（批號ZL-I9610）購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，伊紅染液（水溶）（批號71014544）購自中國國藥集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與研究節(jié)點(diǎn)

48只新西蘭白兔，隨機(jī)分成2組，每組24只，分設(shè)供試品（脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層基質(zhì)）試驗(yàn)組和對照品（生物硬腦膜修補(bǔ)片）對照組。分組后每只動物指定一個(gè)單一的動物號，動物及籠卡上標(biāo)明動物號；并且用不同顏色籠卡進(jìn)行組別區(qū)分，并注明實(shí)驗(yàn)編號、供試品名稱、劑量、組別、性別、動物數(shù)等指標(biāo)。研究設(shè)4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，分別為植入術(shù)后7 d、30 d、60 d、90 d，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只動物。

1.2.2 動物術(shù)前麻醉

動物術(shù)前12 h禁食但不禁水。動物稱體質(zhì)量后，先用3%戊巴比妥鈉以0.5 mL∕kg劑量靜脈注射，進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。3 min后靜脈注射陸眠寧Ⅱ，劑量為0.1 mL∕kg。手術(shù)過程中視動物麻醉深度，多次追加首次劑量1∕4的陸眠寧Ⅱ。術(shù)前于心臟采血2 mL，用于血細(xì)胞五分類分析（儀器購自深圳市普康電子有限公司，PE7600）和血清生化分析（儀器購自珠海森龍生物科技有限公司，SL300B）。術(shù)前一次性肌內(nèi)注射氨芐西林2×105U和慶大霉素4×104U以抗感染。

1.2.3 補(bǔ)片植入

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［4-7］，并根據(jù)臨床實(shí)際情況制定。兔頭固定于頭架上，嚴(yán)格執(zhí)行備皮消毒等無菌準(zhǔn)備后，于顱頂正中處取縱行切口，長約5 cm。依次切開皮膚及皮下組織，鉗夾止血；用無菌記號筆在顱頂正中畫一切口約2 cm的正方形；然后用超聲骨刀沿切口外緣切開顱骨，盡可能保留顱骨完整；取下顱骨骨窗，充分暴露硬腦膜；用腦膜剪在骨窗內(nèi)剪出1.0 cm×1.0 cm大小的圓形硬腦膜缺損，操作時(shí)切勿損傷腦組織。將試驗(yàn)組或?qū)φ战M硬腦膜補(bǔ)片修剪為相應(yīng)形狀，貼附于腦表面，硬腦膜補(bǔ)片與缺損處邊緣重疊約0.3 cm，用醫(yī)用組織膠（購自北京康派特醫(yī)療器械有限公司）固定。植入完成后將顱骨骨窗放回原位固定，縫合皮膚及皮下組織，紗布包扎傷口。手術(shù)結(jié)束后普通飲食飼養(yǎng)，未給予止痛藥物；術(shù)后1～3 d，肌內(nèi)注射青霉素20×105U∕次，1次∕d，以抗感染。

1.2.4 術(shù)后動物情況觀察

植入術(shù)后，觀察動物基本情況，包括手術(shù)期死亡情況、傷口感染（手術(shù)部位有無膿腫，傷口愈合是否良好）、運(yùn)動障礙（四肢行為是否正常，動作是否遲緩，是否有癱瘓）、精神異常（是否消瘦、呆立）、腦脊液滲漏（腦脊液有無滲出）。

1.2.5 血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測

術(shù)前及術(shù)后7 d、30 d、60 d、90 d（安樂死之前），分別采集兩組兔的耳靜脈血，用全自動血細(xì)胞分析儀和全自動生化分析儀分別進(jìn)行血細(xì)胞五分類分析和血清生化檢測。

1.2.6 術(shù)后安樂死及大體解剖

術(shù)后分別在7 d、30 d、60 d、90 d時(shí)對2組動物各6只進(jìn)行安樂死：按動物體質(zhì)量，先肌內(nèi)注射劑量為3 mg∕kg的速眠新，再耳緣靜脈注射劑量為0.4 mL∕kg的10%氯化鉀溶液。然后解剖手術(shù)部位：用超聲骨刀沿手術(shù)部位外緣切開，取顱骨、硬腦膜和腦組織為一體的長約3 cm的正方形標(biāo)本；獲得標(biāo)本后，觀察標(biāo)本橫切面大體外觀，包括手術(shù)部位創(chuàng)面愈合情況、補(bǔ)片降解情況、與腦組織粘連情況、是否發(fā)生腦水腫、是否發(fā)生腦出血、植入后補(bǔ)片位置穩(wěn)定性、植入物吸收并被新生組織替代和組織長入情況等。

1.2.7 組織病理學(xué)觀察

獲取的顱骨、硬腦膜和腦組織標(biāo)本通過蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察比較兩組的手術(shù)周圍組織反應(yīng)情況，評價(jià)內(nèi)容包括粘連情況、纖維增生情況、血管密度和材料降解情況等。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后動物基本情況

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)2組動物均無意外死亡。供試品試驗(yàn)組未見切口感染；對照品對照組有1例發(fā)生切口感染，經(jīng)換藥治療后轉(zhuǎn)歸。剩余動物均于術(shù)后1～3 d恢復(fù)正常采食和飲水。兩組均未發(fā)生運(yùn)動障礙、癲癇、腦脊液滲漏、精神異常及發(fā)熱等現(xiàn)象。

2.2 術(shù)后局部愈合情況

術(shù)后7 d，試驗(yàn)組和對照組動物頭皮均愈合良好，無膿腫、無皮下積液。解剖后發(fā)現(xiàn)：兩組動物植入的硬腦膜補(bǔ)片均與周邊硬腦膜形態(tài)連續(xù)，能完整封閉硬腦膜缺損，無腦脊液漏出，可辨認(rèn)出補(bǔ)片邊界；補(bǔ)片與腦組織可分離，與大腦表面無粘連；腦組織局部均無受壓、充血和水腫，局部無膿腫及滲出（圖1A1、1A2）。

術(shù)后30 d，兩組動物解剖可見顱骨瓣與頭骨之間的縫隙已經(jīng)被纖維瘢痕組織所替代，兩組補(bǔ)片均出現(xiàn)部分降解，與周邊硬腦膜融合長入，補(bǔ)片與大腦表面均無粘連；各腦隙均無積液（圖1B1、1B2）。

術(shù)后60 d，兩組補(bǔ)片均大部分降解，補(bǔ)片邊緣與周邊硬腦膜不能辨別，創(chuàng)面無粘連；硬腦膜下各腦隙未見異常（圖1C1、1C2）。

術(shù)后90 d，兩組硬腦膜及腦組織的解剖形態(tài)已完全修復(fù)，均未發(fā)現(xiàn)明顯異常（圖1D1、1D2）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)的兔硬腦膜修復(fù)情況Figure 1 Rabbit dura mater repair process at the indicated time points

2.3 血液學(xué)指標(biāo)

試驗(yàn)組和對照組相比，術(shù)前及術(shù)后7 d、30 d、60 d和90 d的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)比較Table 1 Routine blood parameters in the two groups of rabbits at the indicated time point（±s,n=6）

表1 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)比較Table 1 Routine blood parameters in the two groups of rabbits at the indicated time point（±s,n=6）

注：試驗(yàn)組植入供試品（國產(chǎn)的脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層基質(zhì)材料），對照組植入對照品（購自美國Cook Biotech Incorporated公司的生物硬腦膜修補(bǔ)片）。各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較均P〉0.05。

指標(biāo)白細(xì)胞計(jì)數(shù)/（109·L-1）淋巴細(xì)胞數(shù)/（109·L-1）紅細(xì)胞計(jì)數(shù)/（1012·L-1）血紅蛋白濃度/（g·L-1）血小板數(shù)/（109·L-1）組別試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組時(shí)間點(diǎn)術(shù)前9.6±0.9 9.5±0.9 3.8±0.4 3.6±0.4 6.4±0.7 6.3±0.7 120.0±14.3 122.0±13.2 349.0±31.2 354.0±27.3術(shù)后7 d 10.4±0.7 10.5±0.8 3.7±0.4 3.7±0.4 6.3±0.8 6.3±0.7 122.0±15.4 122.0±12.6 350.0±30.6 348.0±30.7術(shù)后30 d 9.8±0.5 9.7±0.5 3.7±0.5 3.7±0.4 6.3±0.6 6.3±0.8 123.0±12.7 123.0±20.4 348.0±29.5 351.0±27.4術(shù)后60 d 9.6±1.1 9.8±0.9 3.8±0.3 3.8±0.4 6.4±0.3 6.4±0.6 123.0±11.6 125.0±12.0 352.0±34.1 355.0±29.8術(shù)后90 d 10.0±0.9 9.9±0.7 3.8±0.3 3.9±0.2 6.4±0.5 6.4±0.8 125.0±9.7 125.0±14.7 353.0±30.6 353.0±35.6

2.4 血液生化指標(biāo)

試驗(yàn)組和對照組相比，在術(shù)前、術(shù)后7 d、術(shù)后30 d、術(shù)后60 d和術(shù)后90 d的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶、血清球蛋白、血清白蛋白、尿素氮和肌酸激酶含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)的血液生化指標(biāo)Table 2 Blood biochemical indicators in the two groups of rabbits at the indicated time points（±s,n=6）

表2 兩組兔不同時(shí)間點(diǎn)的血液生化指標(biāo)Table 2 Blood biochemical indicators in the two groups of rabbits at the indicated time points（±s,n=6）

注：試驗(yàn)組植入供試品（國產(chǎn)的脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層基質(zhì)材料），對照組植入對照品（購自美國Cook Biotech Incorporated公司的生物硬腦膜修補(bǔ)片）。各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較均P〉0.05。

生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶ρ/（U·L-1）堿性磷酸酶ρ/（U·L-1）γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶ρ/（U·L-1）血清白蛋白c/（g·L-1）血清球蛋白c/（g·L-1）尿素氮c/（mmol·L-1）肌酸激酶ρ/（U·L-1）組別試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組時(shí)間點(diǎn)術(shù)前41.7±5.9 42.0±5.8 68.2±4.3 68.1±3.8 3.8±0.6 3.8±0.6 40.6±5.8 40.6±3.8 30.1±2.5 30.0±2.1 13.2±1.2 13.2±1.3 146.0±11.4 146.0±15.2術(shù)后7 d 41.7±2.7 41.9±4.2 68.8±4.0 69.0±4.2 69.2±3.2 3.8±0.3 40.8±4.4 40.7±3.8 30.1±1.8 30.3±1.6 13.2±0.9 13.2±1.5 145.0±11.2 144.0±11.3術(shù)后30 d 41.9±2.6 41.9±3.4 68.8±3.8 69.2±3.2 69.5±3.9 3.8±0.7 40.9±2.3 40.9±4.3 30.4±1.3 30.2±2.1 13.2±1.3 13.3±1.1 145.0±11.5 145.0±11.5術(shù)后60 d 41.7±3.0 41.7±3.9 69.3±3.4 69.5±3.9 69.7±3.5 3.8±0.9 40.6±4.4 40.8±6.1 30.2±2.6 30.1±3.1 13.2±1.0 13.2±1.0 145.0±9.6 144.0±11.7術(shù)后90 d 41.8±2.9 41.9±3.5 69.7±3.5 69.7±3.5 6.4±0.5 3.9±0.4 41.0±2.6 40.9±3.5 30.4±2.7 30.5±2.4 13.3±1.0 13.3±1.3 145.0±15.3 145.0±11.6

2.5 病理組織學(xué)檢測

術(shù)后7 d，試驗(yàn)組和對照組兔腦組織在光學(xué)顯微鏡下尚可辨認(rèn)出補(bǔ)片邊緣，補(bǔ)片內(nèi)部可見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)出輕微的炎性反應(yīng)；腦室區(qū)和腦實(shí)質(zhì)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)正常，均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，與補(bǔ)片均未見明顯粘連；補(bǔ)片表層可見成纖維細(xì)胞增生，并可觀察到新生血管（圖2A1、2A2）。

術(shù)后30 d，試驗(yàn)組和對照組兔腦組織在鏡下均不能辨認(rèn)出補(bǔ)片邊緣，補(bǔ)片與硬腦膜組織完全融合，偶見淋巴細(xì)胞，補(bǔ)片內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，可見纖維碎片，提示補(bǔ)片已被宿主細(xì)胞降解；“碎片”之間可見較多成纖維細(xì)胞，也可見新生血管；補(bǔ)片內(nèi)側(cè)面可見內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，局部腦組織正常，蛛網(wǎng)膜正常（圖2B1、2B2）。

術(shù)后60 d，試驗(yàn)組和對照組補(bǔ)片內(nèi)部均未見炎性細(xì)胞，補(bǔ)片內(nèi)部成纖維細(xì)胞密度增高，新生膠原纖維排列規(guī)則，新生血管密度增加，未見明顯瘢痕組織；硬膜內(nèi)側(cè)面內(nèi)皮細(xì)胞密度增高，排列規(guī)則（圖2C1、2C2）。

術(shù)后90 d，試驗(yàn)組和對照組硬膜內(nèi)側(cè)面均可觀察到完整內(nèi)皮，補(bǔ)片均完全降解，可觀察到厚壁成熟血管，膠原纖維排列規(guī)則，蛛網(wǎng)膜邊界清晰，腦實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)正常（圖2D1、2D2）。

圖2 兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兔腦植入部位的HE染色組織學(xué)變化（×100）Figure 2 Histological changes in the implant region of rabbit brain following hematoxylin-eosin staining at the indicated time points after surgery（×100）

3 討論

小腸黏膜下層基質(zhì)是無細(xì)胞的來源于豬小腸的一種基質(zhì)材料，可以為新生細(xì)胞和血管的生長提供附著和支撐功能［8］。研究表明，小腸黏膜下層基質(zhì)材料在與宿主作用后可逐漸成為宿主組織的一部分［9］。本研究中采用的是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的非交聯(lián)型豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)材料，該材料具有良好的生物相容性，DNA殘留量和α-半乳糖基抗原（α-Gal抗原）殘留低，并具有良好的力學(xué)性能。

研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)樣品能夠主動誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生、分化，促進(jìn)新生血管生成，形成排列規(guī)則、致密的纖維層，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成完整的內(nèi)皮層，不影響蛛網(wǎng)膜下腔的完整性，在植入90 d時(shí)實(shí)現(xiàn)了硬腦膜的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)。在上述修復(fù)過程中，國產(chǎn)試驗(yàn)樣品與國外對照樣品的效果之間無明顯差異。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，兩組樣品植入后7 d可觀察到補(bǔ)片內(nèi)部存在炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，補(bǔ)片周圍組織無明顯炎性反應(yīng)表現(xiàn)，植入后30 d炎性細(xì)胞浸潤基本消失。

本研究表明，植入初期的炎性細(xì)胞浸潤可趨化成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞長入，并與材料降解密切相關(guān)。血常規(guī)及血液生化檢測結(jié)果顯示，植入后3 d出現(xiàn)輕度炎性反應(yīng)，術(shù)后1周即明顯減輕，考慮與手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激有關(guān)。小腸黏膜下層基質(zhì)植入體內(nèi)可能會引起以Th2淋巴細(xì)胞增加為主的一過性免疫反應(yīng)，Th2淋巴細(xì)胞不激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生的IgG不引起補(bǔ)體反應(yīng)，因此不會引起顯著免疫排斥反應(yīng)［10］。本研究中HE染色病理組織學(xué)檢測結(jié)果顯示：兩組樣品植入后7 d即出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，并可觀察到補(bǔ)片纖維碎片，提示在植入早期即同時(shí)啟動了降解過程和修復(fù)過程；植入后30 d，可觀察到規(guī)則致密的纖維層和松散的補(bǔ)片纖維同時(shí)存在；術(shù)后90 d時(shí)可觀察到補(bǔ)片完全降解，代之以完整連續(xù)的硬膜結(jié)構(gòu)。總之，通過本研究試驗(yàn)結(jié)果可以證明，國產(chǎn)的豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)材料是一種促進(jìn)硬腦膜損傷愈合的理想補(bǔ)片材料，使用局部愈合良好，無紅腫、滲出等炎性反應(yīng)的發(fā)生，生物相容性良好，可逐漸降解，動物試驗(yàn)證明安全、有效，未來有望用于國內(nèi)硬腦膜缺損的治療。

[作者貢獻(xiàn)]

孫立旦：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集并分析數(shù)據(jù)，撰寫文章；

楊飛霞：實(shí)施研究，采集并分析數(shù)據(jù)，文章內(nèi)容補(bǔ)充與整理；

張迪：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)；

陳澤良：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，技術(shù)支持；

張志慧：實(shí)施研究，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；

李英俊：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及指導(dǎo)；

史利軍：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，經(jīng)費(fèi)獲取。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。?