消毒愈肌膏對糖尿病足大鼠潰瘍組織影響

摘要：目的： 觀察消毒愈肌膏對糖尿病足大鼠潰瘍皮膚組織糖含量和成纖維細胞形態學變化 。方法： 將 Wistar大鼠隨機分為空白組5只、模型組10只、中藥組10只。制作糖尿病足大鼠模型，模型組和空白組： 常規飲食，在患處應用無菌鹽水，無菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。中藥組： 患處消毒愈肌膏，無菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。觀察 3 周。在不同時間段觀察皮膚糖含量的變化和創面的愈合程度，電鏡觀察成纖維細胞形態學變化。結果：治療1周后，模型組和中藥組創面愈合率明顯低于空白組，有顯著性差異（ P <0.05） ; 中藥組創面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（ P < 0.05） ; 治療2、3周后，模型組、中藥組創面愈合率明顯小于空白組，有顯著性差異（P <0.05） ; 中藥組創面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（P <0.05） 。糖尿病足模型大鼠皮膚組織糖含量明顯高于中藥組和空白組，具有統計學意義;而中藥組大鼠皮膚組織糖含量明顯高于空白組，具有統計學意義。結論： 消毒愈肌膏促進糖尿病足潰瘍創面愈合，能降低局部糖含量，糾正成纖維細胞增值與凋亡平衡。

關鍵詞：糖尿病足; 消毒愈肌膏; 成纖維細胞

【中圖分類號】 R587.1? ? 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）03--02

糖尿病足是糖尿病并發癥之一，其創面的難以愈合成 為醫學者關注的問題[1- 2]。成纖維細胞的增值與凋亡異常也是創面的難以愈合因素之一[3]，本實驗通過消毒愈 肌膏對糖尿病足大鼠潰瘍組織的干預，初步觀察糖尿病足大鼠皮膚高糖狀態下，成纖維細胞形態變化，探討消毒愈肌膏防治糖尿病足作用機制。

1.材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠25只，體質量（180-230） g，購于購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于華北理工大學實驗動物中心溫度、濕度、通風良好。

1.2 試劑與儀器

消毒愈肌膏（ 發明專利號： 201310535598.X） ; 溶解鏈脲佐菌素（ STZ） ，美國 Sigma 公司; 低溫高 速離心機（ 湖南湘立科學儀器有限公司） ; 透射電鏡，電子天平，電腦生物組織脫水機切片刀。

1.3 方法

1.3.1 分組與模型制備

25只Wistar大鼠常規喂養一周后隨機數字隨機分為 3 組： 空白組5只、模型組10只、中藥組10只。將模型組、中藥組，禁食 12 h 后， 以 1% 濃度，55.0 mg / kg 的劑量 STZ 腹腔注射，1 周后， 每隔 1 d 監測空腹血糖，連續3次，血 糖均在 16.7mmol /mL 以上，即為 1 型大鼠糖尿病造模成功。將各組大鼠按 0.3 ml/kg 腹腔注射 10% 的水合氯醛麻醉，根據目前對大鼠 DFUs 模型的報道本實驗在糖尿病大鼠的雙后足背部各做一 3 mm×7 mm 的全層矩形皮膚缺損，視為足部潰瘍造模成功，并記為第 0 天。 其飼養密度為 3 只/籠，每天跟換1次墊料，每天換水1次，每二天用 0.5%的碘伏對足部潰瘍消毒 1 次。

瘍大鼠模型。

1.3.2 處理方法

模型組和空白組：常規飲食，在患處應用無菌鹽水，無菌紗布 包扎，每二天換藥 1 次。中藥組：常規飲食，患處消毒愈肌方外敷，無菌油紗條外敷，無菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。觀察3周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1創面的愈合率 足背創面拍照，應用軟件測算創面 面積，計算創面愈合率： 愈合率 = （ 1-當前測量面積 ÷ 原始創面面積） × 100% 。

1.4.2皮膚組織糖含量測定：取皮膚組織塊，稱質量（約為0.2g），冰浴下剪碎，加入預冷的0.24mol/L Ba（OH）2 的溶液1.5ml，勻漿，離心半徑14cm，3000r/min，離心10min，上清液計量后，Beckmancs 生化自動分析儀檢測葡萄糖濃度。按照下列公式計算，皮膚糖含量每克皮膚糖含量毫克每升。

每克皮膚糖含量（mg/g皮膚）=[上清液體積（ml）×糖濃度（mmol/L）×180]/皮膚組織塊濕量（g）×10-3

1.4.3透射電鏡觀察? 取出固定完成的標本，0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，1%的鋨 酸、0.1M 磷酸緩沖液固定2小時，脫水，滲透，包埋，切片，染色，封片，電鏡下觀察糖尿病足皮膚超微結構。

2.結果

2.1各組創面愈合率比較

治療1周后，模型組和中藥組創面愈合率明顯低于空白組，有顯著性差異（ P <0.05） ; 中藥組創面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（ P < 0.05） ; 治療2、3周后，模型組、中藥組創面愈合率明顯小于空白組，有顯著性差異（P <0.05） ; 中藥組創面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（P <0.05） ，見表1

2.2皮膚組織糖含量測定：糖尿病足模型大鼠皮膚組織糖含量明顯高于中藥組和空白組，具有統計學意義;而中藥組大鼠皮膚組織糖含量明顯高于空白組，具有統計學意義。見表2

2.3電鏡對糖尿病足皮膚超微結構觀察結果顯示：消毒愈肌”外用方促進微血管的再生，抗成纖維細胞凋亡。

2.3.1微血管：

正常組：血管內皮細胞正常，細胞器多見，線粒體正常，基底膜正常（圖1）;模型組：內皮細胞染色體有邊集，管腔內細胞較多，血管水腫，線粒體空化（圖 2）;中藥組：內皮細胞正常，線粒體基本正常，部分空化，基底膜基本清晰（圖 3）

2.3.2成纖維細胞

正常組：細胞質內粗面內質網和高爾基復合體發達，線粒體中等量（圖 4）;模型組：細胞核染色質聚集，核間隙增寬，細胞器減少，線粒體空化（圖 5）;中藥組：線粒體空化、水腫，細胞核基本正常，核膜清晰，多見正常細胞器（圖 6）。

3.討論

導致糖尿病足（DF）形成的危險因素有很多，主要包括糖尿病神經病變、外周血管病變、感染概率的增加以及糖尿病皮膚病變。高血糖狀態下，線粒體產生大量 ROS，使氧 化應激水平增高，通過損害內皮細胞、線粒體，導致異常代謝通路激活，促進炎性反應等， 從而加重 DF 的發展[4-5]。吳海霞[5]研究發現糖尿病慢性皮膚潰瘍組患者血清中脂質過氧化 產物 MDA 水平明顯升高，而 CAT、SOD 和 GSHPX 水平明顯降低;NADPH 氧化酶亞基p22、p47、p67 及 gp91 表達明顯升高（P<0.05） ，且細胞凋亡蛋白 Bax、Caspase3 和 Ccaspase9 表達明顯升高，而 Bcl2 表達明顯降低;同時，糖尿病慢性皮膚潰瘍組患者 血清中炎癥因子 TNF-α、IL-2、IL-6 和 IL-10 水平明顯升高。高血糖狀況下， 抗氧化酶糖基化，超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）等抗氧化酶活性降低，活性氧物質增多，細胞氧化和抗氧化狀態失衡，導致細胞 內 ROS 生成增加。高血糖是產生氧化應激的主要原因。

成纖維細胞是真皮內的數量優勢細胞和主要修復細胞之一， 真皮組織的正常代謝及創傷后修復主要依賴于成纖維細胞的生物學行為。增殖和凋亡是細胞生物學行為的主要指標。眾多的氧化應激對大鼠真皮成纖維細胞生物學行為的影響研究中觀察發現， 氧化應激能導致大鼠真皮成纖維細胞生物學行為的異常， 細胞活力下降， 凋亡增加[7]。因此創面組織中氧化應激增強， 那將可能導致創面難愈。

本研究中，筆者應用的消毒愈肌膏依據與糖尿病足病理特點配伍 組成，黃連、黃柏、白芷、甘草、當歸等 10 余味藥物組成，具有解毒消腫、生肌止痛作用。將消毒愈肌膏外用在糖尿病足大鼠局部皮膚上觀察發現中藥組創面愈合率明顯高于模型組，提示外用消毒愈肌膏可以促進糖尿病足潰瘍創面愈合。同時檢測創面周圍皮膚的糖含量發現，中藥組糖含量明顯低于模型組，這一定證明消毒愈肌膏能降低局部糖含量，進一步降低高糖環境下促發氧化應激，進而抑制氧化應激，纖維細胞細胞活力提高， 凋亡減少，促進創面愈合。在電鏡觀察下，模型組纖維細胞表現細胞核染色質聚集，核間隙增寬，細胞器減少，線粒體空化。而中藥組纖維細胞呈現線粒體空化、水腫，細胞核基本正常，核膜清晰，多見正常細胞器。這與課題中的假設相一致。后續的實驗我們將進一步證明，消毒愈肌膏抗氧化作用，糾正纖維細胞增值與凋亡平衡。

參考文獻：

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[5]Hernandez-Beltran N， Moreno CB， Gutierrez-Alvarez AM.Contribution of mitochondria to pain in diabetic neuropathy.Endocrinol Nutr 2013; 60（1）： 25–32

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[7]楊國志，王潤秀，林源，等.氧化應激對大鼠真皮成纖維細胞生物學行為的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復 2007，11（32） ：6428-6431.

作者簡介：李旗（1980 - ） ，男，山東煙臺人，副教授，碩士，研究方向： 中醫治療代謝性疾病。

基金項目：河北省自然科學基金項目（ H2019209565）