人口腔微生物多樣性及功能分析

楊莉莉 李冬娟 丁盼

摘要：消化道從生理上劃分，主要包括口腔、咽部、食道、胃和腸道，口腔微生物群可隨吞咽動作進入胃腸道，有研究提示口腔微生物群—生態平衡紊亂將引起一系列口腔感染性疾病及一些全身性疾病，為探究人口腔微生物群的均勻性、多樣性和組成，并預測菌群的功能變化。本文利用無菌拭子收集頰部黏膜樣本置于口腔拭子DNA保存液中。采用特殊的測序技術對口腔微生物進行測序，并通過生物信息分析，描述口腔微生物結構和多樣性。

關鍵詞：口腔微生物;多樣性;測序

引言：微生物群系是指在一個生態系統（如人體）中共存的所有微生物生命體，微生物群分布在人體的不同部位，有著重要的作用，對維持機體內環境穩態、人類健康有密切關系。口腔微生物群由數十億種微生物組成，僅次于腸道菌群，口腔微生物群對口腔健康和炎癥有促進作用，如因口腔菌群失調促進了Th17介導的牙周炎癥。因此為保持口腔健康及全身健康，進行口腔微生物菌群多樣性及功能性分析十分有必要。

一、口腔微生物多樣性

口腔微生物組指包括細菌、古細菌、真菌、和病毒的微生物總和，因受年齡、環境、地區、飲食習慣等影響口腔微生物顯示出一定的差異性，目前研究表明，口腔微生物的組成中，占主導地位的門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和放線菌門;在屬水平，占主導地位的屬為普魯士菌屬、納瑟氏菌屬、梭桿菌屬、嗜血桿菌屬、鏈球菌屬等。

1、口腔細菌多樣性

口腔細菌中可鑒定出101個不同細菌屬，硬桿菌、放線菌、鏈球菌屬、螺旋桿菌較為常見。

收集健康的未患有口腔疾病且12h內未進行口腔清潔人群的唾液樣本置于含等量裂解液的試管中，并提取DNA，設計引物來擴增微生物16S rRNA基因的一個片段并在核糖體數據庫中進行序列比，利用序列生成系統發育樹，隨后確定種屬。

2、口腔真菌屬多樣性

口腔中有74中可培養真菌屬和11種不可培養真菌屬，其中以曲霉屬、念珠菌屬、枝孢菌屬和酵母菌屬為主導

在飯后1h收集口腔樣本，研究參與者用無菌磷酸鹽緩沖鹽水漱口，將口腔內容物吐于離心管中，離心后提取DNA進行PCR分析，選擇能夠檢測真菌ITS1區域的引物，將標記熒光值進行電泳圖轉化，從而獲得電泳圖中每個峰的歸一化豐度。真菌菌落分析采用多標記454焦磷酸測序技術，進而分析DNA序列。

3、口腔病毒組

相對細菌以及真菌而言，人體口腔中病毒的多樣性并不豐富，已被認知的多以噬菌體、皰疹病毒為主，絕大多數口腔病毒還未屬于未知種類。利用鳥槍測序在進行病毒數據庫比對獲取相關病毒的信息。

4、口腔古細菌組

在建康的人群和患有口腔疾病的人群中均可檢測出古細菌，但目前研究表明這些古細菌不具有致病性，其中口腔甲烷桿菌、史氏甲烷短桿菌可被分離培養。

二、口腔微生物的功能性分析

口腔微生物與宿主之間，存在著一種微妙的平衡關系。當微生物與宿主之間處于平衡狀態時，口腔中的微生物可作為第一道屏障，阻止外源性致病菌的入侵，其中免疫防護的功能;而當微生物與宿主間的平衡失調時，則會誘發多種口腔疾病，甚至會引起全身系統性疾病。

1、齲齒

齲齒屬于細菌性疾病，它可繼發牙髓炎和根尖周炎，甚至引起牙槽骨和頜骨炎癥。齲齒的繼發感染可以導致關節炎、心骨膜炎等全身其他疾病。

目前多數研究認為遠遠鏈球菌和變形鏈球菌在齲齒發生過程中具有重要作用，但分子生物學研究表明，在齲齒發生過程中，以乳酸菌、放線菌和雙歧桿菌是優勢菌種。在進行患有齲齒和健康人群的樣本采集中，無齲齒的人群口腔微生物組構成穩定，而不同年齡段的齲齒患者的口腔微生物組變異較大，其中普雷沃氏菌屬、韋榮球菌屬豐度較高，表現出一定的生物學功能，研究表明部分口腔細菌可能是齲齒患者所缺失或被抑制的，這部分細菌的功能對于齲齒的發生具有重要意義，比如，在兒童患齲齒的患者中，表現出厚壁菌門減少、納瑟氏菌屬增加的特點，而在青年和成年組中，則表現出厚壁菌門增加、變形菌門、納瑟氏菌屬減少的特點，也說明部分菌株隨著年齡的改變功能也在發生改變。

2、牙周炎

慢性牙周炎是由菌斑及其產物導致的慢性感染性疾病，通過比對慢性牙周炎患者和健康人群的口腔微生物，確定優勢菌屬，為慢性牙周炎的治療以及預防提供理論支撐。在該疾病患者的樣本中顯示出螺旋體屬、卡氏菌屬、單胞菌屬的高豐度，其中以革蘭氏厭氧菌為主。同時能夠引起牙周炎的菌屬在其他疾病中有一定的致病性功能，比如牙齦炎、口腔癌及其他系統性疾病。

3、口臭

口臭是指口腔異味，通常是因口腔微生物分解物質而產生揮發性硫化物造成的，而引起口臭的微生物多存在于舌背。通過與健康人群對比，口臭患者口腔微生物表現出更高豐度，其中以韋德纖毛菌和口炎消化鏈球菌為代表，而健康人群則以唾液鏈球菌、真桿菌屬為優勢菌屬。

4、口腔潰瘍

口腔潰瘍常被人們認為是上火的表現，但該病的誘發也與口腔微生物失調有關，表現出一定的周期復發性的特點，而口腔中的鏈球菌、納瑟氏菌屬以及革蘭氏陰性菌的含量降低會使口腔潰瘍的發作頻率升高，而這些菌株是健康人群的優勢菌株，這些菌屬的降低，使得宿主與微生物的相互作用平衡遭到破壞，一些病原體入侵導致口腔疾病，這則體現出口腔微生物的屏障功能。

5、口腔鱗癌

口腔鱗癌被列為全球第八大常見惡性腫瘤，是指發生在口腔包括舌、牙齦、頰、顎等部位的鱗狀上皮癌。在以往研究中，通產認為罹患這種疾病的原因主要是由于吸煙、飲食、病毒感染、紫外線輻射以及個體遺傳，而在最新的研究中發現一些口腔微生物也與癌癥的發生有密切聯系。從口腔鱗癌組織中分離菌株并進行功能性測序，發現某些微生物只定植于腫瘤組織內，說明該菌株后續可作為腫瘤標志物進行研究，比如在癌組織中發現鏈球菌屬、羅氏菌屬顯著減少，微小微單胞菌、梭桿菌屬顯著增加為特點。口腔微生物可通過抑制凋亡、激活細胞增殖通路、促進細胞侵襲從而誘導炎癥進而引發癌癥。

結束語：隨著對口腔中的微生物的多樣性研究以及功能預測的深入研究，為后續研究口腔疾病以及預防提供了思路，可進行檢測疾病中的特定菌種，來進行菌種的抑制或擴大優勢來減緩疾病，甚至作為全身性疾病的預警;在口腔微生物多樣性和功能性的測定中，利用的16SrRNA和焦磷酸測序技術都是十分新穎的，可檢測到許多在口腔微生物庫中未被認知的菌種，而這些菌種是否具有功能，需要進一步的研究，而這對于豐富基因庫和疾病預防具有重要意義。

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【課題項目】天樂酒廠釀造環境中微生物多樣性及功能分析（課題編號：KJ2020A1146）

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