miR-25-3p靶向ADAM15保護膿毒癥誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷

郭偉 黎艷暉 陳亮 李琪

膿毒癥是一種嚴重危及生命的疾病，是全球住院患者死亡的主要原因。內皮細胞是心臟和血管系統的基本組成部分，其形成血管內皮并維持血管穩態[1]。細菌內毒素、炎性因子等刺激可引起血管內皮細胞功能障礙，導致血管屏障功能喪失，進而參與包括膿毒癥在內的多種疾病發生和進展[2]。因此，明確內皮細胞損傷的分子機制為開發新的膿毒癥治療策略至關重要。微小RNA(miRNA)是一種非編碼小分子RNA，參與轉錄后基因表達的調控，越來越多的研究證實其在微調或維持血管內皮功能中具有關鍵作用[3,4]。研究顯示膿毒癥患者外周血中miR-25-3p表達降低，恢復其表達可降低巨噬細胞遷移能力，抑制炎性細胞因子分泌[5]。去整合素金屬蛋白酶15(ADAM15)是由5個胞外結構域和一個包含Src同源對接位點組成的跨膜蛋白，其在調節細胞、基質粘附和信號傳導中具有重要功能。研究指出ADAM15表達增加可提高血管內皮通透性，促進炎性細胞遷移，導致膿毒癥過程中的內皮屏障功能障礙[6]。本研究通過starbase在線分析發現ADAM15是miR-25的潛在靶點，于是推測miR-25-3p可能靶向ADAM15在膿毒癥內皮細胞損傷中發揮作用。脂多糖(LPS)已被證實是導致膿毒癥血管內皮損傷主要致病因素[7]，本研究以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為研究對象，探討miR-25-3p靶向ADAM15對LPS誘導的HUVEC損傷的影響，以期為臨床膿毒癥治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC購于上海奧陸生物科技公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自大連Takara公司；miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA分析試劑盒購于美國ABI公司；噻唑藍(MTT)購于上海貝博生物；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州聯科生物公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒以及乳酸鹽脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；兔源ADAM15、細胞周期素D1(CyclinD1)、p21、β肌動蛋白(β-actin)、B細胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl相關x蛋白(Bax)單克隆抗體以及羊抗兔IgG第二抗體購于上海艾博抗公司；miR-25-3p模擬物(mimics)及其對照(miR-con)、miR-25-3p抑制物(anti-miR-25-3p)及其對照(anti-miR-con)、ADAM15小干擾RNA(si-ADAM15)及其對照(si-con)、空載體質粒(pcDNA)、ADAM15過表達載體(pcDNA-ADAM15)以及熒光素酶報告載體購于廣州銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:HUVEC采用內皮細胞基礎培養基EBM-2在37℃含5%CO2的細胞培養箱中培養。以100 ng/ml的LPS處理第3代對數期HUVEC 24 h建立血管內皮細胞損傷模型[7]。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-25-3p和ADAM15 mRNA表達:使用TRIzol試劑從細胞中分離總RNA。為檢測ADAM15 mRNA表達，使用逆轉錄試劑盒將2 μg的RNA反轉錄為cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix進行RT-qPCR。為了檢測miR-25-3p的表達，使用miRNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，再用miRNA分析試劑盒進行RT-qPCR。2-ΔΔCT法計算miR-25-3p(內參為U6)和ADAM15 mRNA(內參為β-actin)表達量。miR-25-3p上游引物5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3’，下游引物5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；ADAM15上游引物5’-GCTGGCAGTCTC GTCCTACCAGAGGCG-3’，下游引物5’-GGTGCACCCAGCTGCAGTTCAGCTCAGTCC-3’；β-actin上游引物5’-TGGACTTCGAGCAGGAAATGG-3’，下游引物5’-ACGTCGCACTTCATG ATCGAG-3’。

1.2.3 轉染和分組:以5×105/孔的密度接種HUVEC在6孔板中，24 h后使用Lipofectamine 2000將miR-con、miR-25-3p mimics、si-con、si-ADAM15、miR-25-3p mimics與pcDNA、miR-25-3p mimics與pcDNA-ADAM15分別轉染至HUVEC，收獲轉染48 h細胞。用100 ng/ml的LPS處理轉染細胞24 h，根據轉染序列或載體不同分為LPS +miR-con組、LPS +miR-25-3p組、LPS+si-con組、LPS+si-ADAM15組、LPS +miR-25-3p+pcDNA組、LPS +miR-25-3p+pcDNA-ADAM15組。未轉染HUVEC采用100 ng/ml的LPS處理24 h記為LPS組。未處理HUVEC記為PBS組。

1.2.4 MTT實驗檢測細胞活力:以5×103個細胞/孔的密度將各組HUVEC接種于96孔板，37℃培養箱孵育48 h后，每孔分別加入20 μl的MTT試劑，培養箱繼續孵育4 h，每孔再加入150 μl的二甲基亞砜，低速振蕩至結晶溶解。用酶標儀在490 nm波長下測定光密度(OD)值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:將各組細胞重懸于500 μl結合緩沖液中，分別添加10 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI，在室溫下于黑暗環境中孵育30 min后，立即采用流式細胞儀分析樣品。Annexin-V陽性細胞為凋亡細胞。

1.2.6 試劑盒檢測MDA含量以及LDH、SOD和GSH-Px活性:收集各組細胞至離心管內，離心后棄上清。按照試劑盒說明書加入提取液，冰浴、超聲波破碎細胞，4℃離心機10 000 r/min離心10 min，取上清置于冰上。按照各個試劑盒操作步驟分別測定MDA含量以及LDH、SOD、GSH-Px活性。

1.2.7 蛋白質印記檢測ADAM15、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達:使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細胞。12 000 r/min離心10 min去除細胞碎片。蛋白質定量后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上。將膜在含5%脫脂牛奶的緩沖液中封閉1 h，然后與第一抗體(1∶1 000稀釋)在4℃下過夜。β-actin抗體(1∶1 500稀釋)作為內參對照。室溫下與對應的二級抗體(1∶2 000稀釋)孵育1 h后，用電化學發光試劑盒進行印跡顯色。Quantity One定量軟件分析各條帶光密度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗:starbase在線預測miR-25-3p的靶基因。合成含有miR-25-3p結合位點的ADAM15的野生(WT)型3’-非編碼區(UTR)序列以及突變(MUT)型3’-UTR序列。將WT/MUT-3’-UTR序列連接到熒光素酶報告質粒獲得熒光素酶報告載體WT-ADAM15-3’UTR、MUT-ADAM15-3’UTR。將WT/MUT-ADAM15-3’UTR分別與miR-25-3p mimics、miR-con共轉染HUVEC。48 h后裂解細胞。使用雙重螢光素酶報告基因檢測系統測定細胞的螢火蟲和海腎螢光素熒光素酶，以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值表示相對熒光素酶活性。同時將miR-con、miR-25-3p mimics、anti-con、anti-miR-25-3p分別轉染HUVEC，蛋白質印跡法分析ADAM15蛋白表達情況。

2 結果

2.1 miR-25-3p和ADAM15在經LPS處理的HUVEC中的表達水平 與PBS組比較，LPS組HUVEC中miR-25-3p表達量顯著降低，而ADAM15 mRNA和蛋白表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-25-3p和ADAM15 mRNA在LPS處理的HUVEC中的表達水平

圖1 ADAM15蛋白的表達

2.2 miR-25-3p過表達對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響 與PBS組比較，LPS組HUVEC中miR-25-3p表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達量、SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達量、MDA含量以及LDH釋放量顯著升高(P<0.05)；與LPS +miR-con組比較，LPS+miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達量顯著升高(P<0.05)，細胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達量、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達量、MDA含量以及LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表2、3，圖2。

圖2 miR-25-3p過表達對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響;A 細胞凋亡流式圖；B 凋亡、增殖相關蛋白表達

表2 miR-25-3p過表達對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響

表3 miR-25-3p過表達對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

2.3 miR-25-3p與ADAM15直接相互作用 Starbase軟件預測到miR-25-3p與ADAM15之間存在互補的核苷酸序列。與轉染miR-con比較，轉染miR-25-3p mimics顯著降低WT-ADAM15-3’UTR的相對熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-ADAM15-3’UTR的相對熒光素酶活性影響不顯著。與miR-con組比較，miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達量顯著增加，ADAM15蛋白表達量顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與anti-con組比較，anti-miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達量顯著減少，ADAM15蛋白表達量顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、5，圖3、4。

表4 雙熒光素酶實驗

表5 miR-25-3p調控ADAM15的表達

圖3 miR-25-3p與ADAM15存在互補核苷酸序列

圖4 ADAM15蛋白的表達

2.4 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響 與LPS+si-con組比較，LPS+si-ADAM15組HUVEC中ADAM15 mRNA和蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達量、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達量、MDA含量以及LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表6、7，圖5。

圖5 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響；A 細胞凋亡流式圖；B 凋亡、增殖相關蛋白表達

表6 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響

2.5 過表達ADAM15逆轉了miR-25-3p過表達對LPS處理的HUVEC細胞增殖凋亡的影響 與LPS +miR-25-3p+pcDNA組比較，LPS+miR-25-3p+pcDNA-ADAM15組HUVEC中ADAM15 mRNA和蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，細胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達量、SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達量、MDA含量以及LDH釋放量顯著升高(P<0.05)。見圖6，表8、9。

表7 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

圖6 過表達ADAM15逆轉了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC增殖凋亡的影響;A 細胞凋亡流式圖;B 凋亡、增殖相關蛋白表達

表8 過表達ADAM15逆轉了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC細胞增殖凋亡的影響

表9 過表達ADAM15逆轉了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

3 討論

膿毒癥是嚴重感染、創傷、外科手術等的常見并發癥，如不及時治療常引起全身炎性反應、循環障礙以及全身器官衰竭甚至死亡。血管內皮細胞是血管壁的天然屏障，細菌內毒素的暴露和內皮細胞激活將促進膿毒癥進展。本研究通過體外細胞實驗旨在證實miR-25-3p靶向ADAM15對LPS誘導的HUVEC損傷的保護作用。

研究顯示膿毒癥患者血清中miR-25-3p表達異常，是膿毒癥潛在的診斷標記物[8]。膿毒癥大鼠血清、LPS誘導的心肌細胞中miR-25-3p表達亦降低，miR-25-3p的過表達提高了大鼠存活率，抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡，并降低炎性因子的分泌量[9]。本研究中LPS干預后HUVEC中miR-25-3p表達量顯著降低，提示miR-25-3p表達異常可能與LPS誘導的HUVEC損傷有關。轉染miR-25-3p mimics恢復miR-25-3p表達進行功能驗證發現，miR-25-3p過表達顯著提高LPS誘導下HUVEC活力，減輕LPS誘導的細胞凋亡。miR-25-3p的促增殖和抗凋亡作用在其他類型細胞中也被報道。研究表明miR-25-3p通過靶向BTG2促進乳腺癌細胞的體外增殖，而抑制miR-25-3p表達可誘導細胞凋亡[10]。在膠質瘤miR-25-3p對細胞增殖具有促進作用[11]。本研究中miR-25-3p過表達還導致LPS誘導的HUVEC中促凋亡因子Bax表達下調、抗凋亡因子Bcl-2表達上調。因此，miR-25-3p的抗凋亡作用是通過調控線粒體凋亡途徑實現的。miR-25-3p還導致LPS誘導的HUVEC中CyclinD1表達增加，p21表達降低，這提示miR-25-3p的促增殖作用可能與調控細胞周期有關。此外，本研究發現miR-25-3p過表達可以降低MDA含量以及LDH釋放量，升高SOD和GSH-Px抗氧化酶的活性，從而保護HUVEC免受LPS誘導的損傷。這些研究證實miR-25-3p可以保護HUVEC免受LPS誘導的損傷和細胞凋亡。

miRNA主要通過結合靶mRNA的3’非翻譯區(UTR)進而參與靶基因的轉錄后調控[12]。本研究使用熒光素酶報告基因檢測法確認ADAM15是miR-25-3p的潛在靶標，并證實在HUVEC中ADAM15表達受到miR-25-3p的負向調控。ADAM15是一種多功能跨膜糖蛋白，通常情況下ADAM15能夠裂解細胞表面蛋白外結構域，并通過受體脫落參與信號傳遞，其異常表達與慢性炎癥、免疫紊亂以及癌癥轉移有關[13,14]。在LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型中，ADAM15表達增加促進了肺水腫和中性粒細胞浸潤，破壞內皮屏障完整性[15]。內皮祖細胞抑制通過下調ADAM15表達對LPS誘導的肺微血管內皮細胞發揮保護作用[16]。本研究中LPS處理的HUVEC中ADAM15在mRNA和蛋白表達水平顯著上調，表明ADAM15可能參與LPS誘導的HUVEC損傷。功能實驗發現，沉默ADAM15通過上調CyclinD1、Bcl-2表達，下調p21和Bax表達來調控HUVEC細胞增殖和凋亡，并通過提高SOD和GSH-Px活性、降低MDA含量、抑制LDH釋放來減輕LPS誘導的細胞損傷。此外，恢復試驗證實過表達ADAM15顯著減弱miR-25-3p過表達對LPS誘導的HUVEC損傷的影響。

綜上所述，miR-25-3p通過調控ADAM15的表達可保護HUVEC免受LPS誘導的凋亡和損傷，有助于更好了解內皮細胞損傷分子機制，為臨床膿毒癥治療提供潛在有效策略。