miR-126促進子宮肌瘤細胞凋亡的機制研究

張雪 宦大為 劉文月

子宮肌瘤是常見的女性生殖系統良性腫瘤，多見于30～50歲育齡期女性，絕經女性及青少年較少見[1]。子宮肌瘤占全部女性良性腫瘤的半數以上，在婦科常見病中的發病率最高[2]。子宮肌瘤雖然屬于良性腫瘤，但其臨床癥狀多樣，子宮肌瘤也是常見的子宮切除的重要原因[3]。有研究顯示，子宮肌瘤的發生機制復雜，遺傳因素、環境等均可能與子宮肌瘤的發生有關[4]。近年來，基因在子宮肌瘤發生和發展中的作用得到廣泛重視，通過探討基因在腫瘤細胞中的作用，人為的干擾或重建腫瘤相關基因可能是子宮肌瘤治療的途徑[5]。miRNA是一類內源性的小分子RNA，其沒有開放閱讀框，也不具備編碼蛋白質功能，其可以通過影響下游信號通路的轉導發揮生物學功能[6]。人體內幾乎所有細胞中均存在miRNA的表達，這些miRNA不僅參與影響細胞分化、代謝、衰老、凋亡等過程，還影響多種疾病的進展，如關節炎、糖尿病、急性肺損傷等[7]。研究表明，miRNA和腫瘤的關系密切，miRNA在腫瘤的進展中扮演重要角色[8]。既往報道顯示，miR-126在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中表達下調，上調miR-126表達能夠抑制腫瘤細胞惡性生物學行為[9,10]。在肺癌中發現，miR-126通過抑制P13K/AKT信號降低腫瘤細胞惡性生長能力[11]。P13K/AKT是一個在腫瘤中過度激活的信號通路，其可以誘導腫瘤惡性生長，抑制P13K/AKT減緩腫瘤進程[12]。本實驗探討miR-126對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡的作用和機制，為分子靶向治療子宮肌瘤提供可能思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院2017年1月至2018年1月收治的子宮肌瘤患者手術切除的子宮肌瘤組織以及正常子宮肌組織(距離腫瘤組織>3 cm)各51例，p-P13K抗體、p-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology；AKT抗體、C-Caspase-3抗體、cyclin D1抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；P13K抗體購自武漢博歐特生物科技有限公司；p21抗體購自美國Abcam；miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國GeneCopoeia；mimics control、miR-126 mimics購自美國Thermo。

1.2 qRT-PCR方法檢測子宮肌瘤組織中miR-126表達 利用Trizol試劑分別提取子宮肌瘤組織以及正常的子宮肌組織中的RNA，RNA沉淀用DEPC水溶解，長期保存于-80℃冰箱。利用miRNA qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR反應。制備的cDNA合成體系包含以下試劑：3.75 μl的RNA sample、5 μl的mRQ Buffer、1.25 μl的mRQ Enzyme，混合均勻以后放在37℃環境中孵育1 h，然后再置于85℃孵育5 min。把收集到的cDNA放在-20℃條件下保存。配制PCR反應體系，包括：0.5 μl的miRNA-specific Primer、12.5 μl 的SYBR Advantage Premix、0.5 μl的上游以及下游引物、0.5 μl的ROX Dye、2 μl的cDNA，最后以ddH2O補足到25 μl，置于PCR儀上，設置反應程序如下：95℃ 10 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共進行40個循環。PCR反應的引物序列如下：miR-126上游：ACACTCCAGCTGG

GTCGTACCGTGAGTAAT，下游：TGGTGTCGTGGAGTC

G；內參U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AAC

GCTTCACGAATTTGCGT。按照2-△△Ct計算miR-126的表達量。

1.3 子宮肌瘤細胞分離培養 將子宮肌瘤組織剪碎后放在添加有青鏈霉素的PBS溶液中孵育5 min，然后將PBS溶液棄掉，加入Ⅰ型膠原酶，混合后，置于37℃的水浴鍋中消化3 h，添加含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液終止消化，以200目的細胞篩過濾后，4℃，1 000 g離心10 min，收集沉淀，添加新鮮的細胞培養液，放在37℃，5% CO2培養液中培養24 h。期間每隔2 d觀察換液1次。子宮肌瘤細胞呈貼壁生長，分離的細胞經α-actin免疫細胞化學法染色鑒定為子宮肌瘤細胞。收集第3代細胞，用于后續實驗。

1.4 細胞轉染與分組 子宮肌瘤細胞接種到12孔板中，利用轉染試劑Lipofectamine 2000分別將mimics control、miR-126 mimics轉染到細胞中，命名為miR-NC組、miR-126組，設置未轉染的細胞為Control組。細胞轉染的詳細操作步驟按照轉染試劑說明書進行。Control組、miR-NC組、miR-126組細胞培養48 h后，按照1.3中qRT-PCR方法分別檢測細胞中miR-126表達變化。

1.5 CCK-8法分析細胞增殖能力變化 子宮肌瘤細胞種植到96孔板內，每個孔加100 μl的細胞懸浮液，含有5 000個細胞，然后按照Control組、miR-NC組、miR-126組分組方法處理培養48 h以后，將培養板取出，吸取10 μl的CCK-8溶液添加到樣品孔中，繼續放在37℃條件下孵育4 h。以酶標儀測定450 nm的A值，計算細胞存活率變化。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%

1.6 PI單染法分析細胞周期變化 取培養48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細胞，將上清溶液棄掉，然后在細胞中加入適量的PBS溶液反復潤洗細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細胞，添加70%乙醇溶液，置于-20℃冰箱中固定24 h。繼續添加10 μl、100 mg/ml的RNA酶，混合后，置于37℃環境中結合30 min，然后吸取100 μl的PI染色液添加到細胞中，在室溫、避光環境中結合30 min，上流式細胞儀分析并檢測周期變化。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法分析細胞凋亡變化 取培養48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細胞，將上清溶液棄掉，然后在細胞中加入適量的PBS溶液反復潤洗細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細胞，用冰預冷之后的PBS制備成細胞懸浮液(濃度為106個細胞/ml)。用移液槍吸取1 ml的細胞懸浮液，置于離心機中，以900 g離心10 min，把上清溶液棄掉，然后再添加195 μl的結合緩沖液混合，添加5 μl的Annexin V-FITC溶液，置于避光、室溫條件下結合15 min，繼續添加PI溶液5 μl，放在室溫、避光環境中結合15 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.8 Western blot方法分析p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達 取培養48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細胞，將上清溶液棄掉，然后在細胞中加入適量的PBS溶液反復潤洗細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細胞，添加RIPA溶液，放在冰上充分裂解反應20 min，以4℃，10 000 g離心10 min，吸取上清，按照BCA方法檢測蛋白樣品的濃度。吸取5×Loading Buffer與蛋白樣品按照1∶4的比例混合，置于100℃的水浴煮沸5 min。按照常規方法分別配制分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，分別在每個上樣孔中添加40 μg的蛋白樣品，將電壓設置成60 V，肉眼觀察染料即將移動至分離膠時，把電壓調整到100 V，等到染料運動至玻璃板底部后，關閉電源，停止電泳。把凝膠取出，按照凝膠大小裁剪合適的NC膜，置于4℃條件中轉膜，轉膜的電流為恒流200 mA。電泳結束以后，將NC膜置于5%牛血清白蛋白中，置于37℃環境中結合1 h，然后把NC膜置于一抗溶液內，于4℃條件下過夜反應，最后將NC膜放在二抗溶液中，置于37℃條件下結合1 h。利用ECL方法顯色，以Quantity one分析各個條帶的灰度值。內參設置為GAPDH，目的蛋白表達量=目的條帶灰度值÷內參灰度值。p-P13K、P13K、p-AKT、AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1抗體稀釋倍數分別為1∶800、1∶800、1∶800、1∶800、1∶600、1∶1 000、1∶1 000，二抗稀釋倍數為1∶2 000。

1.9 P13K/AKT激活劑IGF-1對miR-126影響子宮肌瘤細胞的作用 取轉染miR-126 mimics的子宮肌瘤細胞，用含有P13K/AKT激活劑IGF-1濃度10 ng/ml的細胞培養液刺激細胞，命名為miR-126+IGF-1組，以miR-126組作為參照，按照1.5、1.6、1.7、1.8中方法分別檢測細胞增殖、周期、凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達。

2 結果

2.1 miR-126在子宮肌瘤組織中表達下調 子宮肌瘤組織中miR-126表達水平低于正常子宮肌組織(P<0.05)。見表1。

表1 miR-126在子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織中的表達變化

2.2 miR-126 mimics上調子宮肌瘤細胞中miR-126表達水平 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細胞中miR-126表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 miR-126 mimics轉染后子宮肌瘤細胞中miR-126水平

2.3 miR-126對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡的影響 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，細胞G0/G1期比例升高，C-Caspase-3和p21蛋白表達增多，cyclin D1蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)。miR-126抑制子宮肌瘤細胞增殖，阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡。見圖1,表3。

圖1 上調miR-126對子宮肌瘤細胞凋亡和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達影響；A 流式細胞術檢測子宮肌瘤細胞凋亡變化；B Western blot檢測子宮肌瘤細胞中C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達

表3 上調miR-126后子宮肌瘤細胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白水平比較

2.4 miR-126對子宮肌瘤細胞中P13K/AKT信號通路影響 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表達減少(P<0.05)。miR-126抑制子宮肌瘤細胞中P13K/AKT信號通路激活。見圖2，表4。

圖2 Western blot方法測定miR-126對子宮肌瘤細胞中P13K/AKT信號通路相關蛋白表達影響

表4 上調miR-126后子宮肌瘤細胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水

2.5 P13K/AKT激活劑IGF-1對miR-126影響子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡的作用 與miR-126組比較，miR-126+IGF-1組子宮肌瘤細胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表達增多，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，細胞G0/G1期比例降低，細胞中C-Caspase-3、p21蛋白表達減少，cyclin D1蛋白表達增多(P<0.05)。P13K/AKT激活劑IGF-1逆轉miR-126對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡作用。見圖3，表5。

圖3 P13K/AKT激活劑IGF-1對上調miR-126的子宮肌瘤細胞凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達的影響；A 流式細胞術檢測子宮肌瘤細胞凋亡變化；B Western blot檢測子宮肌瘤細胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達

表5 P13K/AKT激活劑IGF-1處理和上調miR-126后子宮肌瘤細胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1、p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水平

3 討論

miRNA是近年來研究較多的與生命機體正常生理活動有關的調節分子，屬于小分子非編碼RNA，沒有編碼蛋白質的功能，對細胞生長、凋亡、分化、能量代謝等均有十分重要的調節作用[13]。很多實驗已經證明，miRNA在疾病進展中發揮調控作用，如動脈粥樣硬化、關節炎、哮喘等[14]。miRNA和腫瘤的關系已經有很多報道，miRNA在腫瘤中扮演類似抑癌基因或癌基因的作用，通過靶向調控miRNA的表達可能是腫瘤治療的潛在途徑[15]。miR-126定位在9q34.3染色體上，最早發現于乳腺癌組織，miR-126在血管豐富的組織如肺臟、心臟等組織中高表達[16]。有研究顯示，miR-126在大部分的腫瘤中表達下調，并且miR-126表水平和腫瘤的進展程度負相關，miR-126在腫瘤的治療以及診斷中可能具有潛在意義[17]。在胃癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中已經證明了miR-126發揮抑制腫瘤進展的作用，其可以抑制腫瘤細胞生長并誘導細胞凋亡[9,18]。本實驗表明，miR-126在子宮肌瘤組織中表達下調，并且上調miR-126降低子宮肌瘤細胞生長能力，這也說明miR-126在子宮肌瘤中也可能發揮了抑癌基因的作用。

細胞周期是細胞增殖的基礎，細胞增殖和細胞凋亡之間的動態平衡是維持機體穩態的重要方面。細胞周期分成分裂期和分裂間期，其是指從上一次細胞分裂結束到本次細胞分裂結束的整個過程。細胞分裂間期是細胞分裂的準備階段，受到細胞內多個基因的表達調控作用，細胞分裂間期中有2個重要的調控點，G0/G1向S期進展是其中的1個調控點[19]。cyclin D1是一個細胞周期促進因子，其表達上調后能夠誘導細胞進入S期，促進細胞周期進程，進而誘導細胞增殖[20]。p21是細胞周期的抑制因子，其表達水平升高后細胞周期進展被阻滯。細胞凋亡與細胞周期一樣，均受到多種因子的調控作用[21]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族成員，而Caspase蛋白家族是目前研究的與細胞凋亡關系十分密切的調控子，其蛋白成員被激活后能夠形成凋亡級聯反應，最終誘導細胞凋亡的發生[22]。Caspase-3位于凋亡級聯反應的下游，其只有被活化后形成C-Caspase-3才能誘導細胞凋亡發生。本實驗結果顯示，miR-126將子宮肌瘤細胞周期阻滯在G0/G1期，同時細胞中cyclin D1蛋白表達水平降低，p21蛋白表達水平升高，這說明miR-126可能通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖；miR-126還可以提高子宮肌瘤細胞凋亡率，促進細胞中C-Caspase-3蛋白表達，這提示miR-126誘導子宮肌瘤細胞凋亡。

信號通路在腫瘤進展中發揮十分關鍵的作用，P13K/AKT信號通路是在腫瘤中異常激活的信號轉導通路，下調其激活水平能夠抑制腫瘤進展。P13K、AKT是P13K/AKT信號通路的關鍵蛋白，二者只有被磷酸化以后才可以激活P13K/AKT信號[23]。miRNA發揮作用與調控下游信號有關，其中也包括P13K/AKT信號通路。以前的研究發現，miR-126抑制肺癌、膠質瘤進展與下調P13K/AKT信號通路有關[11,24]。本實驗表明，miR-126下調子宮肌瘤細胞中p-P13K、p-AKT蛋白表達水平，抑制P13K/AKT信號激活，而且P13K/AKT信號激活劑還可以逆轉miR-126對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡的作用，提示miR-126抗子宮肌瘤進展作用與P13K/AKT信號有關。

綜上所述，miR-126可能是一個子宮肌瘤抑制因子，其可以在體外通過調控P13K/AKT信號通路抑制子宮肌瘤細胞增殖，阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡。