miR-3177-3p通過TLR4對香煙煙霧提取物誘導支氣管上皮細胞凋亡的影響

羅榮榮 吳震 邵伯云

慢性阻塞性肺疾病是常見的呼吸系統疾病，其與香煙煙霧有關，香煙煙霧中含有很多種有害物質，可以促進支氣管上皮細胞損傷[1]。支氣管上皮細胞有十分廣泛的生理功能，也是保護氣道組織的第一道屏障，支氣管上皮細胞在損傷修復、生物代謝、抗原遞呈、氧化應激等過程中發揮作用[2]。支氣管上皮細胞是慢性阻塞性肺疾病的重要靶細胞之一，其損傷發生與細胞內多個基因的表達有關[3]。miRNA是一類沒有編碼功能的小分子RNA，其有很多生物學作用，對細胞分化、凋亡、代謝、氧化平衡等均有調控功能[4]。研究表明，miRNA參與慢性阻塞性肺疾病發生，與支氣管上皮細胞損傷有關[5]。既往研究證實，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中表達下調，并且隨著疾病嚴重程度的增加，miR-3177-3p表達水平越低[6]。TLR4是一個多功能調控因子，在細胞凋亡、氧化應激等過程中發揮作用[7]。目前已知TLR4在CSE誘導的支氣管上皮細胞損傷中過度激活，并且下調TLR4抑制支氣管上皮細胞凋亡[8]。本實驗研究miR-3177-3p通過TLR4對CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡的影響，為靶向基因改善慢性阻塞性肺疾病提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 支氣管上皮細胞16HBE購自上海美軒生物科技有限公司；mimics control、miR-3177-3p mimics、pcDNA-TLR4、pcDNA均由北京吉田生物科技有限公司合成構建；Bax抗體、Bcl-2抗體購自美國Abgent；TLR4抗體購自齊一生物科技(上海)有限公司；GSH-Px檢測試劑盒購自上海超研生物科技有限公司；MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；SOD檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發展有限公司。

1.2 CSE的制備方法[9]將已經去掉過濾嘴后的2支香煙于超凈工作臺中點燃，燃燒10 min，抽取的煙霧溶解在體積為50 μl的DMEM/F12中，充分搖勻，然后添加NaOH將pH值調整為7.4，經過0.22 μm的微孔過濾以后，即為濃度為100%的CSE溶液，在實驗時需要用DMEM/F12將CSE稀釋為10%。

1.3 實驗分組 支氣管上皮細胞在含有100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中培養，條件：37℃，飽和濕度，5% CO2、95%空氣。支氣管上皮細胞分成Control組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組，CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組細胞在實驗0 h時，用含有CSE體積分數為10%的細胞培養液培養；CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組細胞在實驗開始前12 h，分別轉染mimics control、miR-3177-3p mimics，細胞轉染方法參照轉染試劑Lipofectamine 2000進行。

1.4 miR-3177-3p表達檢測 應用Realtime PCR方法檢測miR-3177-3p的表達。Control組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組按照上述分組方法培養處理24 h以后，將細胞培養液上清棄掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，取Trizol試劑將細胞裂解，按照常規步驟分別提取各細胞內的總RNA。取200 μg的RNA，添加2 μl的5×gDNA Eraser Buffer、1 μl的gDNA Eraser，最后加RNase free H2O至體積為10 μl，充分混合。然后在上述體系內分別依次添加3 μl的miRNA RT Primer、1 μl的PrimerScript RT Enzyme Mix I、4 μl的5×Prime Script Buffer，最后加入RNase free H2O補足到20 μl，將反應體系放在37℃結合15 min，85℃結合5 s，合成的cDNA放在-20℃保存。然后取cDNA，按照下述方法制備PCR體系，PCR體系包含：0.4 μl的上游和下游引物、10 μl的SYBR Primer Ex Taq、1 μl的cDNA模板，最后添加ddH2O補足20 μl，將PCR儀的反應程序調整為：預變性(95℃ 30 s)；變性(95℃ 5 s)；退火(60℃ 20 s)，一共設置40個循環。然后根據反應中的Ct值，以2-△△Ct方法計算miR-3177-3p的表達，U6作為內參。

1.5 細胞凋亡檢測 4組按照上述分組方法培養處理24 h后，將細胞培養液上清棄掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，在細胞內分別添加PBS溶液將細胞洗滌2次，最后在細胞內添加體積為500 μl 的結合緩沖液，然后添加5 μl的Annexin V-FITC染色液，放在避光條件下孵育20 min，然后再添加5 μl的PI染色液，避光結合15 min。立即用流式細胞儀檢測4組細胞凋亡情況。

1.6 Bax、Bcl-2、TLR4蛋白表達檢測 應用Western blot方法測定Bax、Bcl-2、TLR4蛋白水平。Control組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組按照上述分組方法培養處理24 h后，將細胞培養液上清棄掉，然后加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，分別添加PBS溶液將細胞洗滌2次，添加RIPA裂解溶液，放在冰上充分裂解10 min。將裂解溶液按照4℃，12 000 g離心10 min，蛋白在上清中。吸取適量的蛋白，按照BCA方法分別檢測提取的蛋白樣品的濃度，然后添加5×Loading Buffer，置于100℃條件下煮沸5 min。按照常規步驟分別制備10%的分離膠以及5%的濃縮膠。在每個上樣孔中按照30 μg蛋白樣品上樣。電泳儀的電壓設置為80 V，30 min以后溴酚藍染料即將進入分離膠，然后將電泳儀的電壓設置為100 V，2 h以后溴酚藍染料跑到凝膠的底部。取出凝膠，與NC膜共同浸泡在轉移緩沖液中。設置60 V電壓、4℃條件下轉膜1 h。將NC膜取出，浸泡在含有5%脫脂奶粉的封閉液平皿內把非特異性的位點封閉；TBST溶液洗滌3次。NC膜放在添加有一抗稀釋液的平皿內，4℃孵育過夜，TBST溶液洗滌3次。最后將NC膜置于含有二抗稀釋液的平皿內，37℃環境中結合1 h。按照ECL方法顯色。分析條帶的灰度值。內參為GAPDH。Bax/Bcl-2/TLR4蛋白水平=Bax/Bcl-2/TLR4條帶灰度值÷GAPDH灰度值。

1.7 MDA、SOD、GSH-Px水平檢測 Control組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-3177-3p組按照上述分組方法培養處理24 h以后，將上清溶液棄掉，收集細胞，用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測SOD水平，用比色法檢測GSH-Px水平，具體操作步驟按照MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒說明書進行。

1.8 pcDNA-TLR4對miR-3177-3p影響細胞作用的檢測 分別將miR-3177-3p mimics、pcDNA和miR-3177-3p mimics、pcDNA-TLR4共轉染到支氣管上皮細胞中，然后用含有CSE體積分數為10%的細胞培養液培養，記為CSE+miR-3177-3p+pcDNA組和CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4組，細胞培養24 h以后，按照1.4、1.5、1.6中方法分別檢測細胞凋亡和Bax、Bcl-2、TLR4蛋白表達水平以及MDA、SOD、GSH-Px水平。

2 結果

2.1 miR-3177-3p mimcis對CSE誘導的支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達影響 與Control組比較，CSE組支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達水平降低(P<0.05)；與CSE+miR-NC組比較，CSE+miR-3177-3p組支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達水平升高(P<0.05)。miR-3177-3p mimcis上調CSE誘導的支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達水平。見表1。

表1 miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達水平

2.2 miR-3177-3p mimcis對CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡影響 與Control組比較，CSE組支氣管上皮細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)；與CSE+miR-NC組比較，CSE+miR-3177-3p組支氣管上皮細胞凋亡率降低，細胞中Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05)。上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡。見圖1，表2。

圖1 miR-3177-3p對CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡影響;A 流式細胞術檢測支氣管上皮細胞凋亡結果；B Western blot檢測支氣管上皮細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達結果

表2 miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3 miR-3177-3p mimcis對CSE誘導的支氣管上皮細胞氧化損傷的影響 與Control組比較，CSE組支氣管上皮細胞MDA水平升高，細胞SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05)；與CSE+miR-NC組比較，CSE+miR-3177-3p組支氣管上皮細胞MDA水平降低，細胞SOD、GSH-Px水平升高(P<0.05)。上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞氧化損傷。見表3。

表3 miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞MDA、SOD、GSH-Px水平

2.4 miR-3177-3p mimcis對CSE誘導的支氣管上皮細胞中TLR4表達影響 與Control組比較，CSE組支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達水平升高(P<0.05)；與CSE+miR-NC組比較，CSE+miR-3177-3p組支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達水平降低。上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達。見圖2，表4。

圖2 Western blot方法檢測miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達

表4 miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞TLR4蛋白水平

2.5 pcDNA-TLR4對支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達影響 與CSE+miR-3177-3p+pcDNA組比較，CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4組支氣管上皮細胞TLR4蛋白水平升高(P<0.05)。pcDNA-TLR4上調支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達水平。見圖3，表5。

表5 miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞TLR4蛋白水平

圖3 Western blot方法檢測miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達

2.6 上調TLR4逆轉miR-3177-3p對支氣管上皮細胞凋亡和氧化損傷的作用 與CSE+miR-3177-3p+pcDNA組比較，CSE+miR-3177-3p+pcDNA-TLR4組支氣管上皮細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05)。上調TLR4逆轉miR-3177-3p對支氣管上皮細胞凋亡和氧化損傷的作用。見圖4，表6。

圖4 miR-3177-3p mimcis、pcDNA-TLR4轉染對CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡影響；A 流式細胞術檢測支氣管上皮細胞凋亡結果；B Western blot檢測支氣管上皮細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達結果

表6 miR-3177-3p mimcis轉染后CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平以及MDA、SOD、GSH-Px水平

3 討論

miRNA有很多生物學功能，已經發現其在不同類型的細胞分化、凋亡等過程中發揮重要調節功能，并且miRNA還通過影響細胞生物學行為參與疾病的進展[4]。miRNA沒有編碼蛋白質的作用，其可以通過影響下游基因或信號通路的轉導發揮多重功能[10]。已知miRNA在哮喘、肺腫瘤等呼吸系統疾病中發揮作用，并且miRNA還可能是疾病治療的靶點[11]。在慢性阻塞性肺疾病中發現miRNA參與支氣管上皮細胞損傷過程，其表達改變與細胞凋亡水平有關[12]。有研究發現，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中表達下調，且miR-3177-3p隨著疾病嚴重程度的升高而降低[6]。本結果表明，CSE誘導的支氣管上皮細胞中miR-3177-3p表達水平降低，并且上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡，這可能提示，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中發揮保護功能。

慢性阻塞性肺疾病發生時，支氣管上皮細胞內的氧自由基水平異常升高是導致細胞凋亡水平增加，造成肺組織完整結構被破壞的重要原因[13]。正常情況下，細胞內氧自由基的水平處于動態平衡的狀態，細胞內產生的氧自由基能夠被抗氧化酶降解，使細胞處于低劑量氧自由基狀態，這些氧自由基參與信號轉導、維持氧化平衡[14]。當細胞受到外界因素刺激后，抗氧化酶的活性降低，細胞內氧自由基水平異常升高，導致存在于細胞內的脂質被氧化，造成氧化損傷[15]。MDA是脂質發生過氧化的產物[16]。SOD、GSH-Px分別為細胞內的主要抗氧化酶，其活性的高低與氧自由基水平有直接關系[17]。有報道表明，過量的氧自由基不僅可以造成氧化損傷，還可以激活細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡[18]。Bcl-2是與細胞凋亡關系密切的蛋白家族，其含有多個成員，根據其在細胞凋亡過程中的作用，蛋白成員分成促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，二者表達改變共同調控細胞凋亡進程[19]。結果顯示，上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞中Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達，上調細胞中SOD、GSH-Px水平，下調MDA水平，提示上調miR-3177-3p可能通過改善支氣管上皮細胞氧化損傷而抑制細胞凋亡。

TLR4是Toll受體家族，其可以識別相關病原體而激活下游信號通路轉導，進而參與生命機體進程[21,22]。TLR4參與組織修復、細胞生長、細胞凋亡、能量代謝等過程，是一個具有十分廣泛作用的調節因子[22-24]。以前的實驗結果發現，TLR4在慢性阻塞性肺疾病中過度表達，且下調TLR4抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞損傷[8]。本實驗發現，上調miR-3177-3p抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞中TLR4蛋白表達，并且上調TLR4能夠逆轉miR-3177-3p對支氣管上皮細胞凋亡和氧化損傷的作用，提示上調miR-3177-3p可能通過TLR4參與支氣管上皮細胞損傷。

綜上所述，miR-3177-3p可能是慢性阻塞性肺疾病保護因子，可以抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞凋亡和氧化損傷，并且其機制可能與TLR4有關。