白果內(nèi)酯對組胺誘導的氣道平滑肌細胞AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路及凋亡的影響

鄧鴻杰 譚娟 陳紹平

氣道重構(gòu)是慢性氣道疾病的主要表現(xiàn)特征，涉及氣道壁細胞的組成和功能改變，可導致不同程度的不完全可逆且進行性加重的氣流受限，使相關疾病的治療復雜化[1]。氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cell，ASMC)是涉及氣道的結(jié)構(gòu)細胞，在受到生長因子、炎性遞質(zhì)等外界信號刺激后惡性增殖，進一步釋放促炎、抗炎因子加重氣道炎性反應及氣道重構(gòu)[2,3]。蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路是人體內(nèi)的基礎信號轉(zhuǎn)導通路之一，可調(diào)控下游核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)調(diào)控炎性反應及細胞的增殖、凋亡[4,5]。研究顯示，AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路與膽脂瘤上皮細胞增生的調(diào)控有關，在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞數(shù)量、功能改變中發(fā)揮重要作用[6,7]。白果內(nèi)酯是從銀杏葉中提取的倍半萜類化合物，具有抗炎、抗氧化活性，可通過NF-κB通路減輕非酒精性脂肪肝炎大鼠肝纖維化程度[8]。組胺作為常見的炎性介質(zhì)，可介導慢性炎性反應，影響呼吸道上皮屏障功能[9]。本研究采用組胺誘導ASMC模擬氣道重構(gòu)過程中的炎癥環(huán)境，探討白果內(nèi)酯對組胺誘導的ASMC AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人ASMC細胞(貨號：FE992)購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號：KL-P0032)購自德國merck/sigma公司；組胺、白果內(nèi)酯(貨號：D2466、D0166)購自上海寶曼生物科技有限公司；MTT溶液(貨號：N/A-896)購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；p-AKT抗體、AKT抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體(貨號：ab32505、ab192623、ab183559、ab32536、ab16663、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司；人白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：EK0410、EK0392)購自美國Sciencell公司；人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：YS-E6101)購自上海研生實業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細胞儀(型號：BD FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將ASMC細胞接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，2～3 d換液1次，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合率達85%左右時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度組胺對ASMC細胞增殖的影響:取處于對數(shù)生長期的ASMC細胞，以1×105個/ml、100 μl/孔接種于96孔板，分別加入終濃度為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L的組胺常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞楓150 μl，充分溶解后使用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度(optical density，OD)值。

1.2.3 細胞分組:取處于對數(shù)生長期的ASMC細胞，以1×105個/ml、100 μl/孔接種于96孔或6孔培養(yǎng)板，分為對照組、組胺組、低劑量白果內(nèi)酯組、中劑量白果內(nèi)酯組、高劑量白果內(nèi)酯組。其中對照組不進行處理，組胺組加入終濃度為100 μmol/L的組胺，低劑量白果內(nèi)酯組、中劑量白果內(nèi)酯組、高劑量白果內(nèi)酯組均加入終濃度為100 μmol/L的組胺，并加入終濃度分別為2、4、8 μmol/L的白果內(nèi)酯。

1.2.4 MTT法檢測5組ASMC細胞增殖情況:將按照1.2.3分組處理的ASMC細胞培養(yǎng)48 h，按照1.2.2方法檢測各組OD值。

1.2.5 流式細胞儀檢測5組ASMC細胞凋亡情況:將按照1.2.3分組處理的ASMC細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟進行操作，依次加入5 μl Annexin V-FITC溶液、5 μl PI溶液，避光培養(yǎng)1 h，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測5組ASMC細胞上清液中炎性因子水平:將按照1.2.3分組處理的ASMC細胞培養(yǎng)48 h，1 000 r/min離心5 min收集上清液，按照IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書步驟進行操作，使用酶標儀測定波長450 nm處的OD值，根據(jù)標準液吸光度結(jié)果計算IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測5組ASMC細胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路相關蛋白表達:將按照1.2.3分組處理的ASMC細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加細胞裂解液裂解、離心提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸法進行蛋白定量。凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，分別加入p-AKT抗體、AKT抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標記，1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌，化學發(fā)光法顯色并曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，Tanon 600系統(tǒng)分析條帶灰度，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度組胺對ASMC細胞增殖的影響 與0 μmol/L比較，0.1、1、10 μmol/L組胺處理下ASMC細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，100、1 000 μmol/L組胺處理下ASMC細胞OD值顯著升高(P<0.05)，故后續(xù)實驗中選用100 μmol/L組胺作為處理ASMC細胞的濃度。見表1。

表1 不同濃度組胺處理下ASMC細胞OD值比較

2.2 5組ASMC細胞增殖情況 與對照組比較，組胺組ASMC細胞OD值顯著升高(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細胞OD值均顯著降低(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細胞OD值逐次降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組ASMC細胞OD值比較

2.3 5組ASMC細胞凋亡情況 與對照組比較，組胺組ASMC細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細胞凋亡率逐次升高(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 5組ASMC細胞凋亡情況

表3 5組ASMC細胞凋亡率比較

2.4 5組ASMC細胞上清液中炎性因子水平 與對照組比較，組胺組ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平逐次降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較

2.5 5組ASMC細胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路相關蛋白表達情況 與對照組比較，組胺組ASMC細胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達水平逐次降低(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 5組ASMC細胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路相關蛋白表達情況

表5 5組ASMC細胞中p-AKT、AKT、p-NF-κB p65、NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達水平比較

3 討論

哮喘、慢性阻塞性肺疾病是常見的慢性氣道疾病，發(fā)生氣道重塑后，會引起慢性阻塞性肺疾病患者氣道腔狹窄扭曲及肺氣腫形成，哮喘患者對常規(guī)治療藥物的反應性降低，導致治療難度加大，病死率升高[10]。ASMC同時是氣道重塑的效應細胞及氣道炎癥的靶細胞，在長期炎癥等因素的刺激下發(fā)生增生、凋亡抑制等改變，表達釋放的細胞因子、生長因子及蛋白酶類增多，會引起氣道重塑，最終導致肺功能下降[11]。組胺是常見的炎性介質(zhì)，本研究證實，隨著組胺處理濃度的升高，ASMC細胞OD值逐次升高，即組胺可增強ASMC細胞的增殖能力，且100 μmol/L組胺即可顯著提高ASMC細胞的增殖能力，故選擇100 μmol/L作為后續(xù)實驗中處理ASMC細胞的組胺濃度。

白果內(nèi)酯是從銀杏葉提取物中分離、鑒定出的倍半萜物質(zhì)，占銀杏提取物的2.9%～3.2%[12]。高琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物治療慢性阻塞性肺疾病的療效顯著，能促進氣道重塑，改善呼吸狀態(tài)與肺功能，提高預后。譚玉萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道重塑及肺血管重塑具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，使用組胺處理后，ASMC細胞OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；在此基礎上加入白果內(nèi)酯，ASMC細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示白果內(nèi)酯可抑制組胺對ASMC細胞的增殖促進、凋亡抑制作用，且隨著白果內(nèi)酯處理劑量的升高，對ASMC細胞的增殖抑制、凋亡促進作用越強，但其具體調(diào)控機制尚不清楚。

Priyanka等[15]研究顯示，白果內(nèi)酯通過控制NF-κB和JNK的活化，減少炎性因子分泌，減少低氧誘導的炎性反應對3T3-L1脂肪細胞的影響。熊麗丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B能減少H2O2誘導的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，抑制丙二醛釋放增加，減少活性氧產(chǎn)量，減少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6生成，對人角質(zhì)形成細胞氧化損傷起保護作用。本研究結(jié)果顯示，組胺誘導后，ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高；在此基礎上加入白果內(nèi)酯處理后，ASMC細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，提示白果內(nèi)酯可減輕ASMC細胞中的炎性因子水平，可能通過減輕炎癥刺激，抑制ASMC細胞發(fā)生增生、凋亡抑制改變。

AKT信號通路是細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，可影響下游多種效應分子的活化，在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮關鍵作用[17]。NF-κB通路是炎性反應的關鍵通路，可誘導IL-1β、IL-6分泌[18]。cyclin D1是細胞周期調(diào)控蛋白，在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路與cyclin D1表達密切相關，抑制NF-κB信號通路可抑制cyclin D1的表達[20]。Liu等[6]研究顯示，EGFR/Akt/NF-κB/cyclin D1信號通路激活參與了膽脂瘤上皮細胞的增生機制。阮玲瑛等[7]研究顯示，Akt通路、NF-κB通路、cyclin D1參與Brg1基因敲除后小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞數(shù)量、功能發(fā)生改變的作用機制。本研究結(jié)果顯示，組胺誘導后，ASMC細胞中AKT磷酸化、NF-κB p65磷酸化、cyclin D1蛋白表達水平顯著升高；白果內(nèi)酯處理后，AKT磷酸化、NF-κB p65磷酸化、cyclin D1蛋白表達水平均顯著降低，提示白果內(nèi)酯可抑制組胺對AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路的激活，可能通過抑制AKT激活進而抑制NF-κB p65磷酸化，減輕炎性反應并抑制cyclin D1表達，最終抑制組胺對ASMC細胞的增殖促進、凋亡抑制作用。

綜上所述，白果內(nèi)酯對組胺誘導的ASMC細胞具有增殖抑制、凋亡促進作用，并減輕炎性反應，其作用機制可能與抑制AKT/NF-κB/cyclin D1信號通路激活有關。