腫瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21在肝癌早期診斷中的應(yīng)用研究*

余戀雨，王 宇，唱 凱，陳 鳴

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400038

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最具破壞性的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第5位，死亡率排名第3位[1]。HCC起病隱匿，早期往往無明顯癥狀，易漏診或誤診，臨床癥狀明顯者病情大多已進(jìn)入中晚期，亟待靈敏度更高特異度更強(qiáng)的肝癌標(biāo)志物來及早甄別出早期患者。

血小板是外周血中豐富的無核細(xì)胞碎片，具有形成血栓、監(jiān)測外周血中的病原體、與免疫細(xì)胞相互作用等多種功能。更重要的是，它們可以接受癌細(xì)胞的“教育”。血小板在整個生命周期中可以吸收并攜帶蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，包括mRNA、pre-mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和線粒體RNA等。在腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞可以直接或者間接通過不同的信號分子或受體影響血小板的RNA信息及蛋白質(zhì)水平，形成受腫瘤教育的血小板(TEP)[2-3]。研究表明,TEP RNA正逐漸成為疾病診斷和預(yù)后的潛在新型血清生物標(biāo)志物[4]。TEP RNA作為癌癥診斷的生物標(biāo)志物有許多優(yōu)點(diǎn)：(1)血小板不含細(xì)胞核，因此受到來自基因組DNA的干擾非常小；(2)血小板易于收集、分離和分析，易于在普通臨床實(shí)驗(yàn)室中標(biāo)準(zhǔn)化；(3)TEP miRNA對外界刺激反應(yīng)迅速，能夠?yàn)榘┌Y的進(jìn)展提供動態(tài)miRNA信號，這可能使早期檢測癌癥具有更好的靈敏度[5]。

作為TEP RNA中含量最高的RNA，miRNA是一種小的(20～24個核苷酸)非編碼RNA，通過負(fù)向調(diào)控靶mRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞過程[6]。miRNA譜具有不同的細(xì)胞類型，并產(chǎn)生不同的功能。肝臟miRNA譜可通過調(diào)節(jié)肝臟代謝，在肝臟損傷、纖維化和腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，包括miRNA-122、miRNA-194/192、miRNA-223、miRNA-21、miRNA-155等。其中，miRNA-122是一種肝臟特異性的miRNA，是肝臟發(fā)育和肝臟疾病中的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究表明，miRNA-122在HCC患者肝臟組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，但是在外周循環(huán)中表達(dá)上調(diào)[7-8]。miRNA-21是血液循環(huán)中檢測到的最豐富的miRNA之一，幾乎在所有實(shí)體癌癥中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中起著抗凋亡、促存活的作用[9-10]。本研究探討腫瘤教育血小板源性的 miRNA-122和miRNA-21在HCC中的表達(dá)水平，并評估其對HCC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年12月在本院采集的15例原發(fā)性肝癌患者和15例健康受試者的臨床剩余全血樣本2 mL，分別歸入肝癌組和健康對照組。其中肝癌組男8例，女7例，年齡35～56歲，平均(47.67±6.42)歲；健康對照組男8例，女7例，年齡28～58歲，平均(44.60±9.61)歲。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究納入的原發(fā)性肝癌患者均按照中國臨床腫瘤學(xué)會制定的《原發(fā)性肝癌診療指南2020》明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)已經(jīng)外科手術(shù)治療或多次化療；(2)伴有心、肺等其他重要臟器嚴(yán)重功能不全；(3)伴有嚴(yán)重感染性疾病(包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體感染等)；(4)伴有嚴(yán)重精神疾病；(5)血液標(biāo)本明顯有脂血、渾濁、污染等情況。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均獲得書面知情同意。

1.2方法

1.2.1血小板分離提取(低速離心法) 將所收集的2 mL全血樣本于室溫下，120×g離心10 min提取上清獲得富血小板血漿后再次120×g離心10 min去除血漿中殘留的紅細(xì)胞和白細(xì)胞。使用全自動血細(xì)胞分析儀計數(shù)血小板以確認(rèn)血小板被成功分離提取。隨后在室溫下360×g離心20 min，去除上清以獲得血小板沉淀。

1.2.2血小板中總RNA的提取以及實(shí)時熒光定量PCR(RF-qPCR) 將所獲得的血小板沉淀用miRNA提取試劑盒(德國Qiagen)進(jìn)行總miRNA提取后，用NanoPhotometer?N50對RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，隨后采用miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit(莖環(huán)法，中國生工)將上述總miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用2×SG Fast qPCR Master Mix Kit(中國生工)檢測miRNA-122和miRNA-21的表達(dá)水平，并根據(jù)2-ΔΔCt方法以U6為內(nèi)參分別計算它們的相對表達(dá)量。其中，hsa-miR-122-5p的莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄引物序列為 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC AAA CA-3′，PCR正向引物序列為5′-AAC ACG CTG GAG TGT GAC AA-3′，反向引物序列為 5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′； hsa-miR-21-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為 5′-CTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AGT CAA CA-3′，PCR正向引物序列為5′-CGC GCG CGT AGC TTA TCA GAC TGA-3′，反向引物序列為 5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′；內(nèi)參基因U6的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TA-3′，PCR正向引物序列為5′-AGA GAA GAT TAG CAT GGC CCC TG-3′，反向引物序列為5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′。

2 結(jié) 果

2.1TEP miRNA-122在健康對照組和肝癌組血漿中的相對表達(dá)量 肝癌組TEP miRNA-122的相對表達(dá)量(11.94±6.28)明顯高于健康對照組(1.76±1.37)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。見圖1。

注：A為miRNA-122相對表達(dá)量；B為miRNA-122相對量，***P<0.000 1。

2.2TEP miRNA-21在健康對照組和肝癌組血漿中的相對表達(dá)量 肝癌組TEP miRNA-21的相對表達(dá)量(3.47±1.69)高于健康對照組(1.10±0.53)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖2。

注：A為miRNA-122相對表達(dá)量；B為miRNA-122相對量，***P<0.000 1。

2.3TEP miRNA-122和miRNA-21對原發(fā)性腫瘤的診斷價值 繪制TEP miRNA-122和miRNA-21診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線，結(jié)果顯示，TEP miRNA-122的曲線下面積(AUC)為0.987(95%CI：0.955～1.018)，當(dāng)最佳截斷值為4.46時，約登指數(shù)最高，診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度為93.3%，特異度為100.0% ；TEP miRNA-21的AUC為0.916(95%CI：0.819～1.012)，當(dāng)最佳截斷值為1.88時，約登指數(shù)最高，診斷靈敏度為80.0%，特異度為93.3%。見圖3。

圖3 TEP miRNA-122和miRNA-21診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

3 討 論

早期診斷、早期治療和精準(zhǔn)個體化治療是目前癌癥醫(yī)療方面的目標(biāo)，血清學(xué)標(biāo)志物輔助檢查結(jié)合影像學(xué)方法是主流的診斷肝癌的辦法，但他們早期診斷的檢出率不高，對于肝癌早期診療的價值有限[11]。液體活檢通過檢測腫瘤釋放到血液中的循環(huán)游離DNA、miRNA等核酸分子，以及腫瘤血小板、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體等結(jié)構(gòu)可以突破組織病理活檢的限制，提高血清學(xué)標(biāo)志物的靈敏度和特異度，同時具有非侵入性檢測、均質(zhì)化腫瘤異質(zhì)性、可重復(fù)性高、耗時較短、可以實(shí)時監(jiān)測腫瘤的發(fā)展變化和治療效果等優(yōu)點(diǎn)[12]。

長期以來，血小板一直被認(rèn)為是癌癥的潛在診斷工具。幾項(xiàng)研究表明，簡單的平板計數(shù)已經(jīng)包含潛在的臨床相關(guān)信息[13-15]。除了血小板計數(shù)外，血小板的大小和血小板蛋白標(biāo)記物，如 P-選擇素，也用于基于血液的癌癥診斷和預(yù)后[16]。 KANIKARLA-MARIE等[17]發(fā)現(xiàn)了“富含特異性腫瘤成分的血栓”參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，隨后其對巨核細(xì)胞、血小板、癌癥之間相互作用的研究引出了 TEPs 的概念。在腫瘤組織浸潤時，血小板可以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞的信號，攝取腫瘤RNA并調(diào)節(jié)自身mRNA的剪切成為TEP，另一方面TEP也可以釋放多種生長和促血管生成因子、吸引其他血細(xì)胞，創(chuàng)造有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[18]。因此，異常TEP RNA的表達(dá)和基因測序用于液體活檢診斷腫瘤或靶向治療越來越受到重視。2015年，BEST等[19]通過對283個血小板樣本的mRNA進(jìn)行測序，以96.0%的準(zhǔn)確率將癌癥患者與健康個體區(qū)分開來，并且以71.0%準(zhǔn)確率正確識別出6種不同類型的腫瘤，這項(xiàng)研究證實(shí)了TEP的診斷潛力。除了mRNA,參與RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的非編碼miRNA的水平也在TEP中發(fā)生改變。2019年，WANG等[5]發(fā)現(xiàn)，TEP miR-34c-3p 和 miR-18a-5p 在鼻咽癌中的表達(dá)水平上調(diào)，對鼻咽癌的診斷具有重要的臨床價值。2021年，ZHU等[20]通過生物信息學(xué)分析和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，TEP miR-495-3p和miR-1293在HCC患者和健康對照者中存在差異表達(dá)，提示其可能參與了HCC的病理生理過程。

針對TEP miRNA進(jìn)行液體活檢診斷腫瘤具有很多優(yōu)勢：首先，響應(yīng)外部信號的特定剪接事件與血小板直接攝取(剪接)循環(huán) mRNA 的能力相結(jié)合，可以為 TEP 提供高度動態(tài)的 miRNA 庫，且其具有潛在的癌癥診斷適用性；其次，腫瘤教育血小板上的異常miRNA可以受到血小板的保護(hù)，具有易分離、易儲存及易檢測的優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)，TEP的miRNA-122和miRNA-21在原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)的相對表達(dá)量均顯著高于健康受試者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ROC曲線分析結(jié)果顯示，TEP miRNA-122的AUC達(dá)到0.987，miRNA-21的AUC達(dá)到0.916，表明TEP miRNA-122和miRNA-21的相對表達(dá)水平可以有效區(qū)分肝癌患者和健康受試者。當(dāng)miRNA-122確定最佳截斷值為4.46時，其診斷的靈敏度和特異度分別達(dá)到100.0%和93.3%；而當(dāng)miRNA-221確定最佳截斷值為1.64時，其診斷的靈敏度和特異度分別達(dá)到80.0%和93.3%。因此，TEP的miRNA-122和miRNA-21是具有潛在應(yīng)用價值的肝癌臨床輔助診斷標(biāo)志物，有望補(bǔ)充目前用于液體活檢診斷的生物分子庫。但是，本次研究沒有具體分析TEP miRNA的相對表達(dá)量在不同病理類型和階段、不同臨床分期的肝癌患者中的區(qū)別，而且分析樣本的量較少，所以在將TEP miRNA-122和miRNA-21用于臨床肝癌的早期診斷還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝癌患者血漿中TEP miRNA(miRNA-122和miRNA-21)相對于健康受試者均有較高的相對表達(dá)量，可以作為潛在的診斷肝癌的分子標(biāo)志物，但在不同腫瘤分期、細(xì)胞分化程度等方面是否存在差異性表達(dá)，仍需進(jìn)一步研究。