探討血清lncRNA聯合檢測CEA、CA724、CA199在胃癌診斷中的臨床意義*

吳雯婷，陳 惠，劉 毅，榮婷婷，沈立松

上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092

胃癌(GC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一。近期，世界衛生組織國際癌癥研究機構(IARC)發布的全球最新癌癥數據顯示，2020年全球惡性腫瘤發病率GC排名第五，死亡率排名第四[1]。在我國，GC的發病率與死亡率僅次于肺癌，位居第二[2]。目前，GC的診斷依賴于內窺鏡檢查、病理檢查和血清腫瘤標志物，主要包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199、CA724、CA50等檢測。內窺鏡和病理檢查雖然是GC診斷的金標準，但是由于其取材困難和患者痛苦較大，且血清腫瘤標志物的靈敏度與特異度不高，因此需要優化GC的診斷策略與檢測手段。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質的RNA,其長度超過200個核苷酸[3]。通過大量研究發現，IncRNA在GC、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中都有表達失調的現象[4-6]。有研究報道，FOXD2-AS1、含銅胺氧化酶4的假基因(AOC4P)在多種癌癥中如鼻咽癌(NC)、肝細胞癌(HCC)、GC等都可以升高。目前尚鮮見有關其在GC血清中表達的報道。本實驗通過檢測GC患者和健康對照者血清FOXD2-AS1、AOC4P以及腫瘤標志物CEA、CA199、CA724的表達水平，比較其差異，探討血清FOXD2-AS1、AOC4P及其與CEA、CA199、CA724聯合檢測對GC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2020年5月在本院住院治療的經組織病理學確診的GC患者80例作為研究對象,其中男46例,女34例,平均年齡(63.56±11.60)歲，并根據AJCC第八版進行TNM分期。納入標準:(1)GC患者經病理確診;(2) 入院時為初診GC患者，且術前均未接受放、化療治療。另外選取在本院進行健康體檢的體檢健康者85例作為對照者，其中男42例，女43例，平均年齡(56.68±12.15)歲。

1.2儀器與試劑 血清總RNA提取試劑(德國QIAGEN公司)；逆轉錄試劑(Takara公司)；PCR擴增試劑(上海YEASEN公司)。 QuantStudioTMDx實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；NanoDrop 2000分光光度計(美國THERMO公司)；Cobas 8000全自動化學發光儀(瑞士Roche公司)；細胞培養箱(Revco)；無菌超凈臺(Labconco)；細胞培養液(DMEM，Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS，Gibco，USA)。

1.3方法 標本的采集及處理：采集所有研究對象外周靜脈血3 mL，4 000 r/min離心5 min，將血清置于RNAse-free的Eppendorf管中，-80 ℃凍存備用。

血清RNA的抽提：使用血清總RNA提取試劑(德國QIAGEN公司)提取血清RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的濃度和純度，選取(A)值(A260/A280)在1.68～2.00的樣本用于后續實驗。

RNA的逆轉錄反應：根據逆轉錄試劑(Takara公司)說明書配置20 μL的反應體系進行逆轉錄反應，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA放-80 ℃冰箱凍存。

引物設計與合成：lncRNA RNU1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)：使用QuantStudioTMDx實時熒光定量PCR儀進行擴增，按照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)(上海YEASEN公司)試劑說明書進行反應體系的配置。反應體系如下：SYBER Green Master Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA模板1 μL，無菌超凈水3.8 μL，共10 μL。反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s，40個循環。所有實驗重復3次，結果取其均值。通過熔解曲線評估擴增產物的特異度。應用2-ΔΔCt方法計算血清lncRNA相對表達量。

血清CEA、CA199、CA724檢測：使用Cobas 8000全自動電化學發光分析儀(瑞士Roche公司)及其配套試劑對入組GC患者及健康對照者血清檢測CEA、CA199、CA724的水平。

2 結 果

2.1FOXD2-AS1、AOC4P在細胞株中的表達及定位情況 FOXD2-AS1、AOC4P在6種不同GC細胞株中(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、HGC-27、MKN-45、AGS)中均有表達，表明FOXD2-AS1、AOC4P可以作為GC診斷的潛在生物學標志。同時本研究進一步檢測了這兩種lncRNA在GC細胞株MGC-803的定位情況，實驗發現FOXD2-AS1更多是在細胞質中表達，而AOC4P更多是在細胞核中。見圖1。

2.2GC組織與癌旁組織、GC患者與健康對照者lncRNA的表達差異 TCGA數據庫顯示，FOXD2-AS1在GC中明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。另對16組GC組織及癌旁組織的AOC4P進行檢測，結果顯示AOC4P在GC中明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。對52例初診GC患者、51例健康對照者血清FOXD2-AS1、AOC4P進行檢測，FOXD2-AS1的相對表達量分別為0.054(0.033～0.085)和0.015(0.005～0.027)；AOC4P的相對表達量分別為1.470(0.987～3.472)和0.093(0.030～0.677)。GC初診患者血清FOXD2-AS1(Z=-6.636，P<0.01)、AOC4P(Z=-6.227，P<0.01)的相對表達量明顯高于健康對照者。見圖2。

注：A為FOXD2-AS1在不同細胞株中的表達；B為AOC4P在不同細胞株中的表達；C為FOXD2-AS1、AOC4P在細胞質和細胞核中的表達。

注：A為TCGA中FOXD2-AS1在GC組織及癌旁組織中的表達；B為AOC4P在GC組織及癌旁組織中的表達；C為FOXD2-AS1在GC及健康對照者中的表達；D為AOC4P在GC及健康對照者中的表達。

2.3GC患者和健康對照者CEA、CA199和CA724的表達差異 對52例初診GC患者、83例健康對照者血清腫瘤標志物進行檢測，發現差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 GC患者和健康對照者CEA、CA199和CA724的表達差異

2.4血清FOXD2-AS1、AOC4P的相對表達量對GC的診斷效能 ROC曲線分析結果顯示，FOXD2-AS1、AOC4P、CEA、CA199和CA724的曲線下面積(AUC)別為0.879、0.856、0.699、0.654和0.626；其靈敏度分別為90.38%、84.62%、40.38%、32.69%和67.31%，特異度分別為74.51%、76.47%、80.39%、96.08%和56.86%。見圖3。

圖3 GC患者血清FOXD2、CEA、CA199、CA724的單獨ROC曲線分析

2.5血清FOXD2-AS1、AOC4P相對表達量與CEA、CA199、CA724聯合診斷對GC的診斷效能 通過檢測初診GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P的相對表達量和CEA、CA199、CA724的濃度，分別計算FOXD2-AS1、AOC4P與CEA、CA199、CA724聯合診斷的GC的靈敏度、特異度。用多元Logistic回歸模型預測FOXD2-AS1、CEA、CA199和CA724聯合檢測診斷GC時的AUC最高為0.917，靈敏度和特異度分別為94.23%和74.51%，見表3及圖4。

圖4 FOXD2-AS1、AOC4P與CEA、CA199、CA724聯合診斷的ROC曲線

表3 FODX2-AS1、AOC4P、CEA、CA199及CA724的單獨或聯合診斷效能

2.6GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P表達水平與臨床病理特征的關系 分析GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P的表達與臨床病理特征的關系，發現其與年齡、TNM分期、淋巴結轉移均無明顯相關性(P>0.05)。結果見表4與表5。

表4 GC患者FOXD2-AS1表達水平與病理特征的關系

續表4 GC患者FOXD2-AS1表達水平與病理特征的關系

表5 GC患者AOC4P表達水平與病理特征的關系

3 討 論

GC是起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，由于GC早期癥狀隱匿，缺乏比較可靠的早期診斷標志物。目前我國臨床診斷GC仍依賴于內窺鏡、病理檢查以及血清腫瘤標志物的檢測，但血清腫瘤標志物靈敏度和特異度不高，內窺鏡篩查率低，導致多數患者在確診時已經處于中晚期，其5年存活率僅25.00%[7]。因此，深入研究GC的發病機制和探索新型分子生物學標志物對GC的早期診斷及治療有重要意義。

有研究發現，lncRNA可以通過調控腫瘤相關基因的產生、轉錄水平和轉錄后水平等方面，最終影響GC細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉移等[8]。血液樣本因其易獲得且低侵襲性等優點被視為更理想的檢測樣本，可用于檢測各項指標從而能夠早期發現癌癥并對患者進行預后預測[9-10]。有報道證實,外周血中lncRNAs性質穩定，表達水平不受外源性RNA酶和溫度改變的影響[11-12]。

AOC4P是長度為2 073 bp的lnc RNA,目前為止AOC4P的功能只在結腸癌和肝細胞癌中進行了研究[13-14]。在結腸癌中，AOC4P(也稱為 UPAT)在高致腫瘤結腸癌細胞中通過調節蛋白質的普及和降解參與癌細胞的表觀遺傳調節[14]。在肝癌中,AOC4P表達降低是疾病預后不良的因素之一,可以作為肝癌的獨立預后因子[15]。目前尚未見AOC4P在血清中的表達與GC相關性的研究。而本研究通過實驗發現AOC4P在不同GC細胞株中均可表達，表明AOC4P可以作為GC診斷的潛在生物學標志物。本研究還通過實驗發現AOC4P大多是在細胞核中表達，但是血清中AOC4P的表達并不低。AOC4P可能通過外泌體釋放入細胞外和體液中。有研究發現，外泌體可以幫助細胞核中的lncRNA釋放入外周循環[16]。轉移是一個多步驟的過程，包括腫瘤細胞侵入原腫瘤部位的局部組織，侵入血液和淋巴血管，以及轉移地點的適應和增殖。有證據表明，外泌體參與所有轉移過程[17]。

FOXD2-AS1位于 1p33 染色體，與癌癥的惡化和進展有關。有研究報道，FOXD2-AS1在幾種癌癥中如鼻咽癌(NC)、肝細胞癌(HCC)、GC等都可以升高[18-20]。然而，FOXD2-AS1表達與癌癥臨床病理特征之間的關聯仍然具有爭議性。XU等[20]發現FOXD2-AS1表達與腫瘤大小、TNM階段和淋巴轉移有關，但與性別、年齡的差異無關。SU等[21]報告說，高FOXD2-AS1表達與淋巴結轉移和分化無關。本實驗結果顯示FOXD2-AS1與年齡、TNM分期和淋巴結轉移無關，與上述研究結果相符。但是本課題研究的是血清中的FOXD2-AS1的表達，與組織中的FOXD2-AS1研究結果可能不一致。并且由于標本量小，因此需要擴大標本量深入探討FOXD2-AS1和AOC4P與臨床病理特征之間的關系。

本研究發現，GC初診患者血清中 FOXD2-AS1和AOC4P的相對表達量明顯高于健康對照者，說明二者對診斷GC有明顯的臨床價值。

另外，本研究通過ROC曲線分析，結果顯示FOXD2-AS1和AOC4P的曲線下面積AUC別為0.879和0.856，而單獨檢測CEA、CA199、CA724的曲線下面積僅為0.620、0.595和0.634，說明lncRNA相比較傳統的腫瘤標志物能更好地作為區別GC患者與健康人群及對照人群的指標。本研究還分別分析了FOXD2-AS1與AOC4P與 CEA、CA19-9、CA724聯合檢測的診斷價值，結果發現FOXD2-AS1與CEA、CA199、CA724聯合檢測時AUC(0.917)、靈敏度(94.23%)最高，并且與單獨檢測各項目AUC相比差異有統計學意義。

本研究結果顯示血清中FOXD2-AS1、AOC4P的表達水平可作為輔助GC診斷的良好指標，且FOXD2-AS1與CEA、CA199和CA724聯合檢測可提高對GC的診斷效能。但由于其致病機制尚不明確，且本研究病例數量較少，因此需要更大臨床樣本研究進一步證明。