HSP60和NRF2在透明細胞性腎細胞癌中的表達及臨床價值*

鮑 晨，董學敏，楊靜茹，胡倩倩，柳 俊△，米 琳，王 勇

1.安康市中心醫院病理科，陜西安康 725000;2.安康市中心醫院腎內科，陜西安康 725000;3.陜西省人民醫院腎內科，陜西西安 710068

透明細胞性腎細胞癌(ccRCC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，是ccRCC最常見的病理類型，每年發病率為4.99/10萬[1]。早期ccRCC的治療以根治性手術為主，對于晚期轉移性ccRCC以內科綜合治療如靶向治療、免疫治療等為主[2]。約31%的ccRCC患者術后出現復發轉移的現象，最終導致患者不良生存預后的發生[3]。深入研究ccRCC機制，對ccRCC的診治具有重要的臨床價值。熱休克蛋白60(HSP60)是線粒體中主要的ATP依賴分子伴侶，在維持線粒體蛋白穩態中起至關重要的作用。有文獻表明，HSP60參與包括病毒性感染、炎癥性腸病等多種炎癥性疾病等許多復雜的生理病理過程[4-5]。有研究發現，HSP60在人類多種腫瘤中存在異常表達升高或降低的現象，HSP60能夠促進腫瘤細胞存活、抑制凋亡和促進腫瘤血管生成，是一種新的腫瘤標志物，有利于判斷腫瘤患者的預后[6]。核因子E2相關因子2(NRF2)基因位于2q31.2，該基因編碼蛋白是一種重要的轉錄因子，能夠結合下游靶基因啟動子中的ARE反應元件，參與正常細胞的發育和分化的調節過程。NRF2與腫瘤的發生、發展關系密切。研究表明，在非小細胞肺癌等惡性腫瘤中NRF2表達上調，NRF2能夠激活磷脂酰肌醇3激酶信號通路，導致下游AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的過度激活，促進腫瘤的惡性增殖，是腫瘤患者不良預后的重要標志物[7]。目前HSP60、NRF2在ccRCC中的表達及相互作用關系尚不清楚。本研究通過檢測ccRCC中HSP60、NRF2的表達，初步探討其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年3月在安康市中心醫院(下稱本院)行ccRCC根治術或保留腎單位手術的89例ccRCC患者為研究對象，其中男52例，女37例；年齡37～74歲、平均(49.1±6.3)歲；病理Furhman分級：1+2級33例，3+4級56例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期24例；伴遠處轉移19例，無遠處轉移70例；伴淋巴結轉移 12例，無淋巴結轉移76例。納入標準：(1)首次發現，無放化療及免疫治療史。(2)病理組織學檢查明確為ccRCC。(3)一般狀況良好，能夠耐受手術。排除標準：(1)合并精神障礙性疾病，不能配合治療。(2)合并慢性腎病、腎功能衰竭。(3)合并其他惡性腫瘤?；颊吆图覍倬橥獠⒑炞?，本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測HSP60、NRF2 mRNA表達 將約50 mg的癌組織及癌旁組織冰上剪碎，液氮中研磨，Trizol法提取組織中總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待測。HSP60正向引物序列5′-ATG CTT CGG TTA CCC ACA GTC-3′，反向引物序列：5′-AGC CCG AGT GAG ATG AGG AG-3′，NRF2正向引物序列5′-TCA GCG ACG GAA AGA GTA TGA-3′，反向引物序列5′-CCA CTG GTT TCT GAC TGG ATG T-3′，以GAPDH為內參，正向引物序列5′-GTG TAG ACC TTT TAG CCG ATG C-3′，反向引物序列:5′-GTG CCA GTA CAG TAG CAG TGG-3′。qPCR總反應體系20 μL，包括SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。qPCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共45個循環。HSP60、NRF2 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt值法表示。

1.2免疫組織化學(IHC)檢測HSP60、NRF2蛋白表達 將組織用10.0%組織固定液固定過夜，石蠟包埋后進行切片，切片厚度5 μm，60 ℃烤片1 h；切片入二甲苯兩次，每次10 min；乙醇水化；微波爐抗原熱修復；3.0%H2O2阻斷30 min；5.0%羊血清封閉30 min；一抗37 ℃ 2 h(HSP60、NRF2單抗購自Abcam公司，貨號ab190828、ab76026)；二抗37 ℃孵育2 h；DAB顯色1 min；蘇木素染細胞核30 s；梯度乙醇脫水，封片鏡檢。免疫組織化學評分根據陽性染色強度及染色面積評估。不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分；染色面積<25.0%為1分，25.0%～50.0%為2分，>50.0%為3分。染色強度評分乘以染色面積評分的為免疫組織化學評分。0～2分為陰性，3～9分為陽性。根據免疫組織化學評分，將89例患者分為低表達組(<4分)和高表達組(≥4分)。

2 結 果

2.1ccRCC癌及癌旁組織中HSP60、NRF2 mRNA表達比較 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2 mRNA的相對表達量分別為0.483±0.112、1.725±0.285，癌旁組織分別為1.227±0.265、0.551±0.101，癌組織HSP60的相對表達量明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義(t=24.397，P<0.001)，而NRF2 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(t=36.629，P<0.001)。見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織中HSP60、NRF2 mRNA表達量比較

2.2ccRCC癌及癌旁組織中HSP60、NRF2蛋白表達 癌組織中HSP60、NRF2蛋白主要表達于細胞質和細胞膜。ccRCC癌及癌旁組織中HSP60蛋白陽性表達率分別為84.3%(75/89)、100.0%(89/89)；NRF2蛋白表達陽性表達率分別為47.2%(42/89)、13.5%(12/89)。癌組織中HSP60蛋白陽性表達率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=15.195，P<0.001);癌組織中NRF2蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=23.925，P<0.001)。見圖2。

圖2 癌及癌旁組織中HSP60、NRF2蛋白表達(×200)

2.3ccRCC癌組織中HSP60、NRF2表達的相關性 Spearmen秩相關分析結果，ccRCC癌組織中HSP60與NRF2表達呈明顯負相關(r=-0.520,P<0.001)。配對χ2檢驗結果：兩個指標的關聯性檢驗χ2=8.144,P=0.004，提示兩個指標有密切關聯；差異性檢驗χ2=19.105,P<0.001，提示兩個指標水平相對變化很大，與其呈負相關關系有關。一致性系數Kappa為負值(Kappa=-0.233)，也與差異性明顯及負呈相關關系互為佐證。

2.4ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達量與臨床病理特征的關系 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2的表達與腫瘤分期、遠處轉移及淋巴結轉移有關(均P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理Furhman分級無關(均P>0.05)。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴遠處轉移及伴淋巴轉移的ccRCC癌組織中HSP60表達明顯較低，NRF2表達明顯較高(P<0.05)。見表1。

表1 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達與臨床病理參數的關系

2.5ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達與患者預后的關系 89例ccRCC患者隨訪3年，隨訪過程中4例失訪，死亡27例，病死率為31.8%。HSP60低表達組3年生存率為41.5%(17/41)，明顯高于HSP60高表達組的3年生存率93.2%(41/44)，差異有統計學意義(χ2=30.79，P<0.001)；HSP60低表達組平均生存時間為(23.5±6.1)個月，明顯高于HSP60高表達組的平均生存時間(28.2±6.4)個月，差異有統計學意義(t=3.460，P<0.001)。NRF2低表達組3年生存率為95.2%(40/42)，明顯高于NRF2高表達組的3年生存率41.9%(18/43)，差異有統計學意義(χ2=30.79，P<0.001)，HSP60低表達組平均生存時間為(29.1±6.2)個月，明顯高于HSP60高表達組的平均生存時間(22.4±6.3)個月，差異有統計學意義(χ2=4.941，P<0.001)。

2.6單因素和多因素COX比例風險模型分析影響ccRCC患者生存預后的危險因素 以ccRCC透明細胞癌患者隨訪過程中的生存狀態為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，納入年齡(賦值：1=≥60歲，0=<60歲)、性別(賦值：1=男性，0=女性)、Fuhrman分級(賦值：1=3+4級，0=1+2級)、腫瘤分期(賦值：賦值1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結轉移(賦值：1=有，0=無)、遠處轉移(賦值：1=有，0=無)、HSP60(賦值1=低表達，0=高表達)、NRF2(賦值1=高表達，0=低表達)為自變量。單因素COX分析結果表明，HSP60低表達、NRF2高表達、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期的ccRCC患者生存預后差，多因素Cox回歸分析結果ccRCC組織中HSP60低表達、NRF2高表達、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期是影響ccRCC患者不良預后的獨立危險因素。見表2、3。

表2 影響ccRCC患者生存預后的單因素Cox分析

續表2 影響ccRCC患者生存預后的單因素Cox分析

表3 影響ccRCC患者生存預后的多因素Cox分析

3 討 論

腎癌是常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤。ccRCC是最常見的病理類型，約占所有類型的90.0%。ccRCC的治療包括手術治療、靶向治療及免疫治療等。早期ccRCC根治性手術患者就能獲得滿意的生存預后，但對于晚期ccRCC，患者預后較差。近年來新的藥物如酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑及免疫檢查點抑制劑等的臨床應用，改善了轉移性ccRCC患者的總體生存時間和無進展生存時間[8]。但在臨床治療過程中發現，部分ccRCC患者對藥物治療不敏感或治療后發生耐藥的現象，導致腫瘤進展[9]。深入研究ccRCC的疾病發生的機制，對于ccRCC臨床診斷和治療有重要意義。

熱休克蛋白家族是細胞應激過程中產生的應激蛋白。生理條件下，該家族成員幫助蛋白質或多肽的正確折疊、降解和運輸，其作為分子伴侶,發揮維持內環境穩定，協助細胞存活和抑制細胞凋亡等作用。HSP60是熱休克蛋白家族成員之一，相對分子質量為60×103，作為一種線粒體伴侶蛋白，存在于細胞質或細胞表面。近年來發現，HSP60與腫瘤發生、發展關系密切，不同腫瘤中HSP60發揮不同的生物學功能。MARINO等[10]報道，腫瘤中HSP60作為一種促癌基因，抑制抑癌基因p53和caspase依賴的細胞凋亡，并通過與其他細胞內蛋白的相互作用激活核因子κB途徑，促進細胞增殖。但有文獻報道，HSP60在膀胱癌中發揮抑癌基因的作用，其能夠通過增強腫瘤細胞的免疫原性，增強機體的抗腫瘤免疫殺傷功能，抑制腫瘤細胞的惡性進展[11]。目前，關于ccRCC組織中HSP60的表達研究報道較少。本研究中，ccRCC中HSP60表達明顯降低，目前其機制尚不清楚，可能與非編碼RNA對HSP60的表達調控有關。有文獻報道，腫瘤細胞中miR-17能夠直接結合HSP60 mRNA的3′非編碼區，降低HSP60 mRNA的穩定性，抑制HSP60的表達，進而激活下游腫瘤壞死因子信號通路，促進腫瘤的發展[12]。本文進一步研究ccRCC中HSP60低表達的臨床意義，結果發現，高腫瘤分期、遠處轉移及淋巴結轉移的癌組織中HSP60的表達明顯較低，表明ccRCC中HSP60的低表達促進腫瘤進展。TENG等[13]在體外細胞實驗中證實，沉默ccRCC腫瘤細胞中HSP60的表達會破壞呼吸鏈復合體Ⅰ的完整性并觸發過多的活性氧(ROS)的產生，ROS激活AMPK途徑，促進ccRCC腫瘤細胞惡性增殖的同時，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，導致腫瘤進展。此外，ccRCC腫瘤組織中HSP60低表達患者遠期生存預后較差，并且HSP60低表達是患者不良生存預后的獨立危險因素，提示HSP60可作為新的判斷ccRCC患者預后的腫瘤標志物，值得臨床深入研究。

NRF2是定位于細胞核內的轉錄因子，參與血紅素加氧酶-1(HO-1)、NADH氧化還原酶1(NQO1)等氧化應激通路中多種基因的表達[14-15]。有文獻報道，NRF2在腫瘤的發生發展過程中起重要的調節作用，其作為一種原癌基因，參與激活血管內皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子通路(PDGF)，促進腫瘤細胞的惡性增殖及轉移[16]。本研究中，ccRCC癌組織中NRF2的表達升高，與以往研究結果一致[7]。ccRCC中NRF2表達上調的機制尚不清楚。有學者發現，正常細胞中NRF2受到Kelch樣ECH相關蛋白1(KEAP1)的泛素化調控，腫瘤中KEAP1的表達缺失或降低導致使NRF2的泛素化-蛋白酶體途徑降解失調，從而增加了細胞中NRF2蛋白的量，NRF2易位至細胞核，然后激活其下游癌基因的表達[17]。本研究中，高腫瘤分期、遠處轉移及淋巴結轉移癌組織中NRF2表達明顯較高，提示ccRCC中NRF2促進腫瘤的發生、發展。NRF2的腫瘤促進作用與其對腫瘤代謝的影響有關。研究表明，NRF2能夠誘導腫瘤細胞發生代謝重編程，NRF2激活戊糖磷酸途徑關鍵酶基因的表達，促進腫瘤細胞中由葡萄糖的代謝轉變為嘌呤核苷酸合成代謝，促進谷氨酰胺的生物學合成，谷氨酰胺作為腫瘤細胞重要的營養能量來源，維持腫瘤細胞的增殖能力[18-19]。本研究發現，ccRCC中NRF2高表達患者的生存預后較差，提示NRF2可能是判斷ccRCC患者生存預后的分子標志物。多因素COX回歸分析結果發現，NRF2高表達是ccRCC患者不良預后的獨立危險因素。因此，本研究通過檢測ccRCC癌組織中NRF2的表達，有助于對患者的預后進行初步評估，指導后續治療和隨訪。

本研究通過相關性分析發現，ccRCC中HSP60與NRF2的表達呈負相關。蛋白質組學研究表明，在腎腫瘤細胞中沉默HSP60表達能驅動ccRCC的代謝重編程，激活NRF2介導的氧化應激反應，增強線粒體依賴性谷胱甘肽的生物合成，以促進腫瘤進展[13]。因此，ccRCC中HSP60可能對NRF2的表達存在調控關系，但二者的具體作用關系值得深入探索。

綜上所述，ccRCC中HSP60表達降低，而NRF2表達升高，HSP60與NRF2表達呈負相關。HSP60及NRF2表達與ccRCC腫瘤分期、遠處轉移及淋巴結轉移有關，二者共同參與ccRCC的發生、發展，是新的ccRCC預后判斷的腫瘤標志物。但HSP60與NRF2間的機制及其在ccRCC中的臨床意義有待深入研究。