NF-κB參與感染誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞DcR3表達(dá)升高的初步研究*

陳洪衛(wèi),侯彥強(qiáng)

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201600

膿毒癥是由各種致病性微生物(包括細(xì)菌、真菌)侵入人體而引起的全身炎性反應(yīng)。近年來膿毒癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其細(xì)菌成分內(nèi)毒素(LPS)、脂磷壁酸(LTA)以及酵母聚糖(zymosan)是重要的致病物質(zhì)，可導(dǎo)致組織損傷和膿毒癥的發(fā)生[1]。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞的大量活化參與了膿毒癥發(fā)病的病理過程[2]。誘騙受體3(DcR3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種缺乏穿膜結(jié)構(gòu)域的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤組織中的表達(dá)都有不同程度上調(diào)，其主要功能為抑制炎癥、抵抗凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清DcR3表達(dá)升高，為了進(jìn)一步探討DcR3在膿毒癥中的功能及表達(dá)升高的機(jī)制，本研究用革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分LPS、革蘭陽性菌細(xì)胞壁的主要成分LTA以及真菌細(xì)胞壁的主要成分zymosan刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并檢測(cè)細(xì)胞上清液以及細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)水平的變化，旨在闡明核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)參與感染誘導(dǎo)DcR3表達(dá)升高的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料來源 采用購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司的HUVEC，分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA和10、100、1 000 μg/mL zymosan，低、中、高3種濃度刺激HUVEC,設(shè)置4個(gè)處理組：LPS組、LTA組、zymosan組和正常對(duì)照組(未經(jīng)過LPS、LTA和zymosan刺激的HUVEC)。

1.2儀器與試劑 大腸桿菌內(nèi)毒素0111：PDTC、V0126、PD9859、B412630、CTA以及zymosan均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TLR2以及TLR4抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DcR3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)置于上海蔚霆生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑、DcR3和GAPDH抗體購(gòu)置于上海生工生物工程有限公司。iMark酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯樂公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司；FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 -80 ℃冰箱中取出HUVEC細(xì)胞凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，不停搖動(dòng)，使其在1 min內(nèi)融化，無菌條件下吸出細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸接種于培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞瓶時(shí)，進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗一次，再加入1.5 mL胰酶消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓、間隙增大時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基終止反應(yīng)，反復(fù)吹打細(xì)胞重懸，1∶3轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4藥物誘導(dǎo)細(xì)胞 調(diào)整并計(jì)數(shù)細(xì)胞使各孔105個(gè)細(xì)胞，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁達(dá)到約80%時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞2次后，分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA和10、100、1 000 μg/mL zymosan，低中高3種濃度刺激細(xì)胞，刺激時(shí)間為12、24、48 h，各小組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5采用ELSIA檢測(cè)細(xì)胞上清液DcR3水平 單克隆抗體(mAb)包被ELISA板過夜，次日洗板，5%牛血清清蛋白(BSA)封阻。將各組細(xì)胞上清液及DcR3純標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中室溫孵育2 h，洗液洗板4次，加入生物素化的二抗室溫孵育2 h，洗液洗板4次，加入辣根過氧化物酶結(jié)合物工作液室溫孵育30 min，洗液洗板4次，加入顯色底物(TMB)，避光孵育15 min，加入終止液，混勻后在酶標(biāo)儀上測(cè)量A450。以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各組細(xì)胞上清液中DcR3濃度。

1.6qPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá) Trizol裂解細(xì)胞抽提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR green法對(duì)DcR3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。DcR3特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。利用ABI 7500 qPCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。收集每個(gè)PCR延伸期的熒光，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線檢測(cè)特異性，經(jīng)SDS2.2軟件分析循環(huán)閾值(Ct)值。以GAPDH作為內(nèi)參(表1)。采用2-ΔΔCt表示計(jì)算mRNA的表達(dá)，其中ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)，ΔCt=Ct(靶基因)-Ct(內(nèi)參基因)。

表1 DcR3和內(nèi)參GAPDH引物序列

1.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá) 以RIPA裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒定量后，取50 μg蛋白，水浴煮沸10 min后進(jìn)行10.00%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5.00%脫脂蛋白室溫封閉2 h，加入適量的DcR3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，0.10%的PBST漂洗3次，每次5 min。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗3次，每次5 min。結(jié)果用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，以X線膠片曝光、顯影和定影，并觀察結(jié)果。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)水平 在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，以PBS洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液與5 μL FITC-抗人TLR2單抗及5 μL PE-抗人TLR4單抗混勻；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，置4 ℃下孵育30 min，PBS洗3次后重懸于PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CellQuest軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1HUVEC細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)水平 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)水平。如圖1所示，HUVEC細(xì)胞表面既表達(dá)TLR2又表達(dá)TLR4。其中表達(dá)TLR2的細(xì)胞百分比為(82.23%±2.15%)，表達(dá)TLR4的細(xì)胞百分比為(77.87%±1.06%)。

2.2LPS、LTA以及zymosan刺激細(xì)胞后上清液中DcR3表達(dá)水平的改變 如圖2所示，低濃度LPS(0.1 μg/mL)、LTA(5 ng/mL)以及zymosan(10 μg/mL)刺激細(xì)胞后上清液中DcR3表達(dá)水平無明顯升高，中、高濃度LPS(1.0、10.0 μg/mL)、LTA(50、500 ng/mL)以及zymosan(100、1 000 μg/mL)刺激細(xì)胞后上清液中DcR3表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且高濃度組DcR3表達(dá)水平比中濃度組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。高濃度刺激后12 h,上清液中DcR3的表達(dá)稍有升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)到24 h，上清液中DcR3的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3LPS、LTA以及zymosan刺激細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)變化 高濃度LPS(10.0 μg/mL)、LTA(500 ng/mL)以及zymosan(1 000 μg/mL)刺激細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)見圖3。正常對(duì)照組、高濃度LPS刺激組、高濃度LTA刺激組以及高濃度zymosan刺激組細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為(1.00±0.05)、(2.28±0.26)、(1.98±0.30)、(2.10±0.16)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，經(jīng)高濃度LPS、LTA以及zymosan刺激后細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。刺激12 h后，細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

注：A為分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA以及10、100、1 000 μg/mL zymosan刺激細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)上清液中DcR3的表達(dá)；B為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細(xì)胞12、24、48 h后，收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)上清液中DcR3的表達(dá)；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

注：流式檢測(cè)細(xì)胞TLR2和TLR4受體；A為陰性對(duì)照；B為TLR2表達(dá)；C為TLR4表達(dá)。

2.4LPS、LTA以及zymosan刺激細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá)變化 Western blot檢測(cè)LPS、LTA以及zymosan刺激后細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá)見圖4，用高濃度LPS(10.0 μg/mL)、LTA(500 ng/mL)以及zymosan(1 000 μg/mL)刺激后細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5NF-κB信號(hào)通路參與了DcR3的表達(dá) 在用LPS、LTA以及zymosan刺激的同時(shí)加入P38 MAPK抑制劑或NF-κB抑制劑，24 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)以及上清液中DcR3的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，加入NF-κB抑制劑PDTC后，細(xì)胞上清液以及細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)較未加抑制劑組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而加入P38 MAPK抑制劑U0126和PD9859后，細(xì)胞上清液及細(xì)胞內(nèi)DcR3的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)；B為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細(xì)胞12、24、48 h后，收集細(xì)胞，qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

注：A為westen blot結(jié)果；B為DcR3與GAPDH的灰度比；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

注：HUVEC細(xì)胞分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan處理的同時(shí)加入100 μm NF-κB抑制劑(PDTC)或20 μm ERK抑制劑(U0126)或JNK抑制劑(PD9859),細(xì)胞處理24 h后，收集上清液和細(xì)胞。A為上清液中DcR3表達(dá)水平的變化；B為細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)水平。

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身性炎性反應(yīng)，研究表明，多種病原微生物的細(xì)胞壁成分(如革蘭陰性菌的LPS、革蘭陽性菌的LTA以及真菌的zymosan等)具有強(qiáng)大的抗原刺激能力，均可通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化，釋放大量炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致失控性炎性反應(yīng)[1-2]。有資料表明，TLRs是病原微生物跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的重要受體，介導(dǎo)了多種病原微生物的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，其中TLR2和TLR4的作用尤為顯著。TLR2識(shí)別能力廣泛，能夠識(shí)別革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、螺旋體以及支原體等多種病原體的成分；而TLR4的識(shí)別能力較為局限，可能主要參與了LPS的識(shí)別與信號(hào)傳遞過程[4]。由于內(nèi)皮細(xì)胞的激活在膿毒癥中發(fā)揮了核心作用，本研究首先檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞表面TLRs受體的表達(dá)情況，結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC細(xì)胞表面既表達(dá)TLR2又表達(dá)TLR4。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清中DcR3表達(dá)水平明顯高于健康者，且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但DcR3在膿毒癥中表達(dá)升高的機(jī)制目前尚不明確[5]。本研究利用不同細(xì)菌的細(xì)胞壁成分作為抗原刺激HUVEC細(xì)胞后，觀察細(xì)胞內(nèi)以及上清液中DcR3表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，LPS、LTA以及zymosan刺激HUVEC細(xì)胞，均可引起細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)升高，其程度呈時(shí)間、濃度依賴性，同時(shí)上清液中DcR3的表達(dá)也升高。已知DcR3是新近發(fā)現(xiàn)的一種缺乏穿膜結(jié)構(gòu)域的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，其在自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤組織中都有不同程度地表達(dá)上調(diào)。有研究證實(shí)，DcR3具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化、炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌的功能，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫監(jiān)視[6]，提示DcR3可能參與膿毒癥早期病理生理發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，LPS、LTA以及zymosan刺激HUVEC細(xì)胞，均可引起細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)升高，其中LPS的受體主要為TLR4，而LTA以及zymosan的受體主要為TLR2，由于TLR2和TLR4的胞內(nèi)區(qū)在結(jié)構(gòu)和功能上具有部分相似性，因此二者在細(xì)胞胞內(nèi)具有一些共同途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，其中主要的兩條途徑為：(1)TLR2/TLR4-髓系分化蛋白(MyD88)/IRAK-NF-κB途徑；(2)TLR2/TLR4-MyD88/IRAK-絲列原活化激酶(MAPK)途徑[7]。為了進(jìn)一步研究DcR3表達(dá)升高的具體機(jī)制，本研究在LPS、LTA以及zymosan刺激的同時(shí)，加入NF-κB和MAPK信號(hào)通路抑制劑，以檢測(cè)DcR3的表達(dá)情況。結(jié)果表明，加入NF-κB抑制劑PDTC后，DcR3的表達(dá)水平明顯下降，而加入MAPK抑制劑U0126和PD9859后，DcR3的表達(dá)水平無明顯變化，這說明DcR3的表達(dá)與激活NF-κB通路有關(guān)，而與p38 MAPK通路無關(guān)。

NF-κB是一種特殊的核蛋白因子，能與多種蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與眾多與免疫、炎性反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也參與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控等過程[8]。在MAPK通路中，ERK和JNK是并列的兩條通路，也是被人們了解最多的成員，該通路的激活在炎性反應(yīng)過程中也起著關(guān)鍵作用，如產(chǎn)生炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6等，還參與細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期運(yùn)行等過程[9]，但本研究發(fā)現(xiàn)在HUVEC細(xì)胞中，MAPK抑制劑不能阻斷LPS、LTA以及zymosan誘導(dǎo)的DcR3的表達(dá)升高，進(jìn)一步說明了在體外培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中，革蘭陰性菌、革蘭陽性菌以及真菌通過TLRs-MyD88-NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)DcR3的表達(dá)，參與炎癥的發(fā)生，本研究結(jié)果初步闡述了DcR3在膿毒癥中表達(dá)升高的機(jī)制，下一步筆者將通過過表達(dá)以及干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)DcR3在膿毒癥中的功能進(jìn)行研究。