多囊卵巢綜合征患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA表達與疾病嚴重程度及預后的關系*

李 佩，穆 丹，陳利平，曹 陽

監利市人民醫院婦產科，湖北監利 433300

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種復雜的婦科內分泌紊亂癥候群，嚴重威脅女性身心和生殖健康[1]。大部分PCOS患者患病后肥胖程度增加可能會影響患者體內脂代謝、胰島素抵抗等，進而影響病情進展[2]。性別決定區Y框蛋白9(SOX9)基因缺陷可能會導致機體發育不良[3]。WAN等[4]研究結果顯示，SOX9表達水平在卵巢發育的前4個階段保持穩定，在第三卵黃發生階段下降。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)對脂代謝調控具有重要作用[5]。石超逸等[6]研究表明，PPARγ在PCOS的發病機制中發揮著重要作用。此外，PPARγ可通過對SOX9進行負向調控參與胃癌的發展[7]。推測SOX9、PPARγ在PCOS病情進展中也可能發揮調控作用，然而目前關于SOX9、PPARγ在PCOS患者中的研究較少。因此，本研究通過初步探討血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA與PCOS患者病情及預后的關系，以期為PCOS發病機制的進一步探究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年1月于本院住院治療的102例PCOS患者作為PCOS組，年齡22～30歲，平均(26.09±3.17)歲；選取同期99例體檢健康女性作為對照組，年齡22～30歲，平均(25.46±3.04)歲。根據出院后1年內患者是否不孕，將其分為預后良好組66例(出院后1年內懷孕)和預后不良組36例(出院后1年內不孕)。本研究經醫院倫理委員會批準；所有研究對象均自愿參加，并簽署知情同意書。

納入標準：(1)PCOS患者符合《多囊卵巢綜合征中國診療指南》中的診斷標準[8]；(2)臨床資料齊全；(3)依從性好，且能順利隨訪。排除標準：(1)近3個月服用過激素類藥物者；(2)認知功能障礙或精神異常者；(3)伴腎功能不全等慢性系統疾病，或高血壓、先天性心臟病等心血管疾病及內分泌疾病者；(4)伴有子宮內膜異位癥、子宮畸形者；(5)無糖尿病家族史或伴有惡性腫瘤。

1.2儀器與試劑 RNA提取試劑盒(批號：TR205-50)購自北京天漠科技開發有限公司；熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,批號：218076)購自德國QIAGEN公司；反轉錄試劑盒(批號：RP1105)購自上海振譽生物科技有限公司；熒光定量PCR參比染料(Rox reference dye,批號：7710005)購自杭州新景生物試劑開發有限公司。全自動生化分析儀(型號：Cobas 6000)購自瑞士羅氏公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存 采集體檢健康女性體檢當天及PCOS患者入院第2天(納入患者時均選擇其月經周期第3～5 d)清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-20℃保存待測。

1.3.2一般資料收集 查閱門診及住院病歷，收集患者入院時一般資料，包括年齡、體質量指數(BMI)。采用全自動生化分析儀檢測空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)水平。

1.3.3血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA相對表達水平測定 采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對SOX9、PPARγ及其內參GAPDH進行擴增。反應體系共20 μL：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，正反向引物(10 μM)各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，ddH2O 6 μL，Rox reference dye(50×)0.4 μL，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個循環。每個樣品重復3次，采用2-ΔΔCt法計算血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4病情類型[9]根據PCOS患者病情類型，將其分為：A型組[無排卵或稀發排卵(O)+雄激素水平升高的生化和臨床表現(HA)+卵巢多囊樣改變(P)]23例、B型組(O+HA)27例、C型組(HA+P)26例、D型組(O+P)26例。

2 結 果

2.1對照組與PCOS組一般資料比較 對照組與PCOS組年齡、E2、FSH、FPG比較差異無統計學意義(P>0.05)；PCOS組BMI、FINS、T均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組與PCOS組一般資料比較

2.2對照組及不同病情類型PCOS患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA相對表達水平比較 對照組、A型組、B型組、C型組、D型組血清SOX9 mRNA相對表達水平依次降低，PPARγ mRNA相對表達水平依次升高，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 對照組及不同病情類型PCOS患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA相對表達水平比較

2.3PCOS患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA與T、BMI、FINS水平的相關性 Pearson分析結果顯示，PCOS患者血清SOX9 mRNA與PPARγ mRNA呈負相關(r=-0.649；P<0.001)；SOX9 mRNA與T、BMI、FINS呈負相關(r=-0.498,-0.512,-0.523，P<0.05)；PPARγ mRNA與T、BMI、FINS呈正相關(r=0.502、0.476、0.517，P<0.05)。見圖1、表4。

表4 PCOS患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA與T、BMI、FINS水平的相關性

圖1 PCOS患者血清SOX9 mRNA與PPARγ mRNA水平的相關性

2.4預后良好組與預后不良組血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA及T、BMI、FINS水平比較 預后不良組SOX9 mRNA相對表達水平顯著低于預后良好組，PPARγ mRNA、T、BMI、FINS水平均顯著高于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 預后良好組與預后不良組血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA及T、BMI、FINS水平比較

2.5影響PCOS預后的多因素Logistic回歸分析 將PCOS患者是否不孕作為因變量，排除年齡、E2、FSH、FPG等混雜因素后，以SOX9 mRNA、PPARγ mRNA、T、BMI、FINS為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示PPARγ mRNA是影響PCOS患者不孕的獨立危險因素(P<0.05)，SOX9 mRNA是影響PCOS患者不孕的保護因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響PCOS預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

PCOS在育齡期婦女中較為常見，是引起不孕不育的主要原因之一，其主要病理特征是性激素分泌紊亂[10-11]。有研究表明，PCOS的主要病理機制是高雄性激素血癥及胰島素抵抗，但免疫功能異常、炎癥因子激活、氧化應激等同樣影響PCOS的病情進展[12]。PCOS造成的不孕等不良預后嚴重影響女性生殖功能，同時給患者和其家庭帶來沉重的生理和心理負擔[13]。深入了解PCOS病理機制對制訂針對性治療措施有重要作用。

SZCZUKO等[14]研究表明，PCOS患者因受肥胖等多種因素影響，機體內發生胰島素抵抗，致使FINS分泌量增加。本研究中PCOS患者血清FINS水平高于健康女性，與SZCZUKO等[14]結果基本一致，均提示胰島素抵抗在PCOS病情進展中發揮重要作用。SOX家族是一類核轉錄因子，與早期胚胎發育有關，在神經發生、軟骨形成等眾多發育過程中發揮重要作用[15-16]。SOX9在不同信號通路中可能呈現不同的生物調節作用[17]。PPARγ是PPAR家族在卵巢顆粒細胞中的重要表達亞型，對胰島素-糖代謝穩態的調控具有重要作用[18-19]。PPARγ激活后可通過調控脂肪細胞因子或其下游因子的表達，進而影響脂肪細胞分化和內分泌功能[20]。CHEN等[21]研究結果顯示，肝星狀細胞中SOX9可以與PPARγ啟動子的瘦蛋白反應區域中-2275周圍的位點結合，同時抑制PPARγ的表達，表明SOX9與PPARγ間有互相調控的作用。本研究結果顯示，PCOS患者血清SOX9 mRNA水平顯著降低，PPARγ mRNA水平顯著升高，二者變化趨勢與病情嚴重程度相平行，且二者在PCOS患者中呈負相關。提示SOX9 mRNA、PPARγ mRNA可能分別通過低表達和高表達參與PCOS的發生、發展，推測PCOS患者病理狀態下SOX9 mRNA水平降低后負靶向調節PPARγ mRNA，使其表達水平升高，PPARγ mRNA影響胰島素信號通路及脂肪代謝相關因子的表達，導致患者體內發生胰島素抵抗，影響PCOS病情進展。朱磊等[22]研究表明，低氧訓練可通過影響大鼠肝臟微小RNA-27(miR-27)/PPARγ通路，調控其下游脂肪酸代謝相關基因，進而影響脂代謝水平。本研究結果中PCOS患者血清SOX9 mRNA、PPARγ mRNA與T、BMI、FINS均呈一定的相關性。進一步說明SOX9 mRNA、PPARγ mRNA在PCOS患者胰島素抵抗中發揮重要作用。此外，PCOS預后不良患者SOX9 mRNA呈低水平，PPARγ mRNA、T、BMI、FINS呈高水平，且SOX9 mRNA、PPARγ mRNA是患者預后不良的影響因素。進一步提示SOX9 mRNA、PPARγ mRNA可能不僅通過胰島素抵抗參與PCOS疾病的進展，還可能影響患者預后，造成不孕等情況發生。本研究受實驗條件、地域等因素影響，需豐富樣本量、納入更多影響因素進一步深入研究，同時還需借助細胞及動物試驗探索其具體作用機制。

綜上所述，PCOS患者血清SOX9 mRNA表達水平降低，PPARγ mRNA表達水平升高，且隨病情加重，其趨勢變化更加明顯，同時二者與患者預后也有一定的相關性。SOX9 mRNA、PPARγ mRNA可能影響PCOS的發生發展，且有可能成為PCOS輔助治療的靶基因。