CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平與ACS患者GRACE評分的關系*

李 櫻，黃 媛，陳 獻，王亦文

1.武警特色醫學中心軍人全科醫學科，天津 300162；2.武警后勤學院臨床醫學系，天津 300162； 3.武警特色醫學中心急診醫學科，天津 300162；4.河北醫科大學 第一醫院心臟中心心功能科，河北石家莊 050000

急性冠狀動脈綜合征 (ACS) 是臨床常見的以老年人群為主要發病群體的一種心血管疾病。ACS主要是由冠狀動脈發生粥樣硬化形成斑塊且斑塊不穩定導致的急性綜合征，可分為不穩定型心絞痛(UAP)、急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)或非急性ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)，其中不穩定斑塊纖維帽破裂、內膜淺表糜爛是ACS的主要病理基礎[1-2]。目前已有研究證實，ACS的發生和病程進展與機體的免疫機制密切相關，其中CD4+T細胞作為機體免疫反應中重要成員，可通過表達多種炎性反應因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)參與早期動脈粥樣硬化的形成過程，從而在ACS病程中發揮關鍵作用[3]。針對上述免疫因素和免疫炎癥應答反應的治療方案研究逐漸成為目前ACS的重要研究方向之一。近年來有研究報道T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白-3(TIM-3)作為表達于免疫細胞表面的一種重要抑制性分子，可以通過對T細胞功能發揮調控作用參與機體免疫耐受[4]。CD4+CD45RA+T細胞屬于初始T細胞，經抗原刺激后轉化為記憶T細胞即CD4+CD45RO+T細胞，記憶T細胞被刺激激活后可以迅速活化，并具備一系列細胞因子分泌功能以強化機體免疫功能。但目前關于TIM-3在CD4+T細胞中的表達情況以及其對ACS患者T細胞功能調控作用的報道罕見。本研究旨在探討CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平在ACS發病過程中作用機制，從而為該病的診斷治療提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年3月武警特色醫學中心收治的212例ACS患者作為研究組，并以同期168例非冠心病檢查者作為對照組。212例ACS患者中UAP、STEMI、NSTEMI患者分別有85例、69例、58例。根據全球急性冠狀動脈事件注冊(GRACE)評分結果對ACS組患者病情進行分級，分為低危組(GRACE<109 分，68例)、中危組(109≤GRACE≤140分，62例)以及高危組(GRACE>140分，82例)。所有研究對象均在知情同意書上簽字，且本研究得到武警特色醫學中心倫理委員會批準。

納入標準：(1)研究組患者均經冠狀動脈造影確診為冠心病，且各分型符合ACS診斷標準[5]；對照組為因出現可疑心肌缺血癥狀入院檢查，行冠狀動脈造影后確定為冠狀動脈狹窄程度<50%或冠狀動脈正常的非冠心病患者。(2)年齡60～80歲者；(3)無認知功能障礙，具備基本讀寫能力者。

排除標準：(1)嚴重全身性炎癥、嚴重肝、腎功能異常或精神疾病；(2)既往診斷患有風濕性心臟病、嚴重心力衰竭、急性心肌梗死或心臟瓣膜病變等疾病，以及左主干嚴重病變；(3)惡性腫瘤、自身免疫性疾病或血液系統疾病；(4)1年內行重大手術或外傷；(5)接受過冠狀動脈支架植入術或冠狀動脈旁路移植術；(6)近半年內服用細胞毒性藥物、皮質醇類激素或升白細胞藥物。

1.2方法

1.2.1一般資料收集 收集所有患者的一般臨床資料，主要包括年齡、性別、血壓(收縮壓、舒張壓)、身高、體質量、高血壓史、糖尿病史以及相關實驗室血清檢查指標等。所有患者入院后30 min、藥物開始治療前抽取肘靜脈血液標本，行血常規全項、心肌損傷標志物[心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]、腎功能、腦鈉肽(Pro-BNP)以及血脂相關指標[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)]檢測。

1.2.3冠狀動脈造影 由兩名及以上具有豐富冠狀動脈造影臨床經驗的醫師進行冠狀動脈造影檢查，檢查過程中所有醫生均嚴格按照手術流程進行操作。并安排兩名經驗豐富的且具有冠狀動脈介入資格的副高級以上職稱專家對每例研究對象冠狀動脈造影結果進行評估，并界定左右冠狀動脈及主要分支狹窄程度，認為冠狀動脈直徑狹窄程度<50%符合冠心病診斷[5]。

1.2.4GRACE評分 參考文獻[6]，納入年齡、收縮壓、血肌酐、心率、Killip分級等8個臨床指標并輸入計算機系統中進行計算。GRACE評分為1～372分。根據GRACE評分結果，參考相關文獻[6]報道的分組方法，對ACS組患者病情進行分級，分為低危組(GRACE<109 分，68例)、中危組(109分≤GRACE≤140分，62例)以及高危組(GRACE>140分，82例)。

1.2.5外周血中CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平測定 分別于對照組體檢時以及研究組入院后抽取靜脈血5 mL于肝素抗凝管中，并統一置于4 ℃冰箱中保存，將下層細胞分離后取100 μL采用流式細胞儀(廠家：賽默飛世爾；型號：Attune NxT)檢測兩組CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平。分別加入CD45-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復合物(PerCP，美國BD公司)、CD45RA-異硫氰酸熒光素(FITC，美國貝克曼公司)以及抗CD4FITC(美國BD公司)和抗TIM-3-PE(美國BD公司)進行免疫熒光抗體標記。將所有樣品放置于4 ℃條件下孵育30 min，進行充分洗滌后加入適量多聚甲醛(濃度為4%)PBS溶液進行固定，然后對CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平進行檢測。

2 結 果

2.1對照組、研究組一般資料的比較 兩組研究對象年齡、性別、體質量指數、糖尿病、高血壓、收縮壓和心率等一般基線資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2兩組患者生化指標水平及CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平比較 研究組ACS患者生化檢查指標TC、TG、LDL、cTnI、Pro-BNP、CK-MB以及CD4+CD45RA+T細胞、CD4+TIM-3+T細胞水平均高于對照組，HDL水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者生化指標水平及CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平比較

組別ncTnI(μg/dL)Pro-BNP(μg/dL)CK-MB(μg/mL)CD4+TIM-3+T細胞水平CD4+CD45RA+T細胞水平研究組21211.52±3.20174.62±11.2551.02±3.240.196±0.0380.166±0.042對照組1680.07±0.0285.46±10.472.98±1.630.158±0.0400.102±0.035t52.09879.102187.9499.4028.605P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.33組ACS患者生化指標及CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平比較 高、中、低危組ACS患者間生化指標和CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組ACS患者生化指標及CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平比較

組別ncTnIPro-BNP(μg/dL)CK-MB(μg/mL)CD4+TIM-3+T細胞水平CD4+CD45RA+T細胞水平高危組8213.41±3.69ab194.42±12.26ab69.47±5.32ab0.168±0.041ab0.188±0.041ab中危組6210.07±3.23a87.48±10.58a43.98±4.23a0.136±0.039a0.148±0.039a低危組686.10±2.1256.17±8.6234.21±4.100.122±0.0350.115±0.032F100.4493470.5901162.65027.69010.848P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.4ACS患者CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平與GRACE評分相關性分析 Pearson相關分析顯示，ACS患者的CD4+TIM-3+T細胞水平、CD4+CD45RA+T細胞水平均與GRACE評分呈正相關(r=0.644、0.518，P<0.05)。

2.5CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平診斷高危ACS患者ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，CD4+TIM-3+T細胞診斷高危ACS患者最佳截斷值為0.129，曲線下面積為0.856(95%CI：0.790～0.910)，靈敏度、特異度分別為79.27%、78.46%。CD4+CD45RA+T診斷高危ACS患者最佳截斷值為0.165，曲線下面積分別為0.837(95%CI：0.874～0.901)，靈敏度、特異度分別為75.61%、80.77%，見表4。

表4 CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平對高危ACS患者診斷價值

2.6不同CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平患者院內心臟不良事件發生率比較 分別以CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平最佳截斷值為界值，低CD4+TIM-3+T細胞組[18.46%(12/65)]院內心臟不良事件(新發心力衰竭、心律失常、心源性休克、再梗死和全因死亡)的發生率明顯低于高CD4+TIM-3+T細胞組[44.22%(65/147)]，差異有統計學意義(χ2=12.927，P<0.05)；低CD4+CD45RA+T細胞組院內心臟不良事件發生率[24.19%(15/62)]患者明顯低于高CD4+CD45RA+T細胞組[41.33%(62/150)]，差異有統計學意義(χ2=5.572，P<0.05)。

3 討 論

GRACE評分是目前臨床首選的一種ACS患者入院時評分系統，也是目前針對ACS患者進行風險管理和評估預后情況的有效指標之一[7]。GRACE評分以8個預后變量為基礎建立一種預測性邏輯模型，從而在GRACE風險計算器中計算以得出預后評分，以評估ACS患者治療期間以及出院后的心血管意外發生風險[8]。目前已有研究證實ACS患者的冠狀動脈病變嚴重程度、左心功能不全、院內外心臟不良事件發生率均與GRACE評分存在顯著相關性，是評估ACS長、短期預后的一種可靠評分工具[9]。

多種免疫機制及免疫細胞如T淋巴細胞、巨噬細胞以及單核細胞均參與冠心病和ACS發生及發展過程。CD4+T細胞也稱輔助/誘導性T細胞(Th)，包括調節性T細胞、Th1、Th2、Th17等亞型。CD4+T細胞具有合成和產生細胞因子功能，能夠協助B細胞分泌抗體并發揮調節其他T細胞免疫應答功能，在維持免疫平衡中發揮關鍵作用[10]。動脈粥樣硬化斑塊中主要以CD4+T細胞為主，其對動脈粥樣硬化抗原進行特異性識別后，會啟動一系列免疫反應并促進白細胞介素(IL)-2、TNF-α、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)等促炎因子分泌以及免疫細胞在血管中的黏附，從而進一步加重血管炎性反應和動脈粥樣硬化斑塊形成與進展[11]。CD4+CD45RA+T細胞在體內經抗原刺激后轉化為記憶T細胞即CD4+CD45RO+T細胞，記憶T細胞被刺激激活后可以發生迅速活化，然后具備一系列細胞因子分泌功能以強化機體免疫功能。但在人體外周血中大部分Treg表型屬于CD45RA-，僅可檢測一部分初始T細胞的表型屬于CD45RA+[12-13]。本研究結果顯示，研究組生化檢查指標以及CD4+CD45RA+T細胞水平高于對照組，HDL水平低于對照組(P<0.05)。提示ACS患者的CD4+CD45RA+T細胞經抗原刺激后轉化為記憶T細胞數量一定程度上減少，ACS患者的免疫機制受到一定程度的抑制。說明機體免疫系統和T細胞參與ACS發生、發展，但其具體機制仍有待進一步研究。馬岳等[14]研究結果顯示，UAP、STEMI、NSTEM與非冠心病者相比，外周血中CD4+CD45RA+T細胞比例明顯升高，且CD4+CD45RO+T細胞比例明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但3組患者間相比，CD4+CD45RA+T細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)。分析可能原因如下，CD4+CD45RA+T細胞分化具有一定可逆性，其發生分化后可能會再次表達CD45RA抗原。且ACS患者3組亞組雖然表現類型不同，但均屬于冠狀動脈粥樣硬化病理改變，因此CD4+CD45RA+T細胞比例變化差異不顯著[15]。

TIM-3是新近發現的一種新型免疫調節分子，其在分化中末期Th細胞上具有表達選擇性，且具有介導免疫耐受反應作用。研究報道抑制TIM-3表達已經成為部分實體瘤進行針對性免疫治療的重要研究方向，且已經取得一定成效[16]。TIM-3可以通過抑制CD4+T、CD8+T細胞的活性，從而減少相關炎癥因子的分泌。已有前期研究證實冠心病患者T細胞以及自然殺傷T細胞表面的TIM-3表達水平高于健康人群[17]。禹海文等[18]研究報道TIM-3還可以通過抑制血管內皮細胞中LDL表達從而誘導和促進動脈粥樣硬化斑塊形成，加重冠狀動脈粥樣硬化及ACS患者病情進展，且研究發現慢性心衰患者 CD8+T 細胞和 CD4+T 細胞中TIM-3陽性細胞比例均呈高表達。本研究結果顯示，研究組CD4+TIM-3+T細胞水平高于對照組(P<0.05)，與禹海文等[18]研究結果相似，提示CD4+TIM-3+T細胞水平在ACS等心血管病變疾病中發揮重要作用。ACS和心力衰竭患者外周血中CD4+TIM-3+T細胞水平高表達提示機體出現了T細胞功能紊亂。本研究進一步證實高、中、低危組3組ACS患者間生化指標和CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平差異均有統計學意義(P<0.05)。提示不同病情嚴重程度ACS患者的T細胞功能紊亂程度不一致。相關分析顯示，ACS患者CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平分別與GRACE評分呈正相關，對于評估ACS患者疾病嚴重程度及預后評估方面具有一定臨床價值。ROC曲線分析發現，CD4+TIM-3+T細胞、CD4+CD45RA+T細胞水平診斷高危ACS患者均具有較高診斷價值。低CD4+TIM-3+T細胞組[18.46%(12/65)]院內心臟不良事件的發生率明顯低于高CD4+TIM-3+T細胞組[44.22%(65/147)]，差異有統計學意義(P<0.05)；低CD4+CD45RA+T細胞組院內心臟不良事件發生率[24.19%(15/62)]明顯低于高CD4+CD45RA+T細胞組[41.33%(62/150)]，差異有統計學意義(P<0.05)，進一步證實CD4+TIM-3+T細胞和CD4+CD45RA+T細胞水平對于ACS患者病情嚴重程度和預后的評估具有一定價值，且具有簡便和可操作性強等優勢。

綜上所述，ACS患者CD4+CD45RA+T 細胞、CD4+TIM-3+T細胞水平均顯著高于健康人群，且二者均與ACS患者GRACE評分呈正相關，并對預測高危ACS和患者預后情況具有較高診斷價值。