長期ART中HIV-1抗體存在的水平變化特點及其與HIV-1儲存庫相關關系的研究

張 晴，高 林，郭曉燕，孜來古麗·米吉提，郭云天，CHEN Wei-wei，焦艷梅，王福生

HIV-1是一種能攻擊人體免疫系統的病毒，在沒有接受任何治療的情況下，對免疫系統中的CD4+T淋巴細胞進行大量破壞[1]。截至2020年底，全球有3770萬人感染了HIV-1，其中150萬人為新發感染者，約有68萬人死于AIDS相關疾病[2]。隨著抗反轉錄病毒治療（antiretroviral therapy, ART）的推廣，HIV-1感染者的病毒載量得到了有效控制，但由于HIV-1儲存庫的存在，ART停止后病毒載量會出現反彈[3]。因此，HIV-1儲存庫是AIDS功能性治愈的最大障礙，HIV-1儲存庫的定量檢測對評估HIV-1儲存庫的大小至關重要。

目前檢測HIV-1儲存庫大小的方法有定量病毒生長試驗、Alu-gag PCR和tat/rev誘導的有限稀釋法等[4]，但以上方法操作復雜且檢測結果存在爭議[5-6]。所以研究者試圖探索出一種新的方法來檢測HIV-1儲存庫大小。目前已有多項研究報道了HIV-1抗體水平與HIV-1儲存庫大小有關聯[7-9]。HIV-1特異性抗體是由HIV-1刺激機體的免疫系統產生的一類免疫球蛋白，主要包括結構蛋白、調控蛋白和輔助蛋白[10]。以上HIV-1特異性抗體發揮作用不同，且不同抗體水平與HIV-1儲存庫大小的關系尚未明確。另有研究表明p24抗體水平與HIV-1感染者的臨床狀態有關，是較好的隨訪檢測標志物[11]，關于p24抗體水平和HIV-1儲存庫大小的關系值得探討。

目前評估HIV-1儲存庫大小最常用的指標是總HIV-1 DNA和細胞相關RNA（cell-associated RNA, CA-RNA）[12-13]，本研究納入接受ART 5年的HIV-1感染者，檢測患者的p24抗體、總HIV-1特異性抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平，探討長期ART患者的p24抗體和總HIV-1特異性抗體水平及其與HIV-1儲存庫大小的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2009年11月—2013年7月于解放軍總醫院第五醫學中心接受ART的147例HIV-1感染者作為研究對象。納入標準：①HIV-1/AIDS診斷參照《中國艾滋病診療指南（2018版）》[14]中相關診斷標準；②經ART滿5年；③ART6個月內患者HIV-1 RNA降至檢測下限。排除標準：①臨床信息不完整；②妊娠期婦女；③合并其他病毒感染（如HBV、HCV等）；④有HIV-1相關機會性感染；⑤死亡患者。排除不符合條件的感染者，最終有27例HIV-1感染者納入本研究。本研究已通過我院倫理委員會批準，且所有入組患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細胞分離 用EDTA-K2真空采血管采集入組對象的靜脈血2 ml、5 ml，其中2 ml管用于CD4+和CD8+T淋巴細胞計數的測定；5 ml管離心10 min后，上層血漿用于病毒載量的檢測，余下的細胞采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。

1.2.2 全血CD4+和CD8+T淋巴細胞計數 移取50 μl HIV-1感染者的EDTA抗凝全血置于絕對計數管中，加入20 μl CD3/CD4/CD8/CD45的組合抗體（美國BD公司），震蕩混勻后于室溫下避光孵育25 min，然后加入450 μl溶血素（美國BD公司），混勻后繼續室溫孵育20 min，孵育結束后使用FACS Calibur型流式細胞分析儀檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞的絕對數，并進行CD4/CD8比值的計算。

1.2.3 血漿HIV-1 RNA病毒載量檢測 使用NPA-32P核酸純化儀（杭州博日公司）先提取樣本的RNA，然后使用HIV-1套式反轉錄熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒（杭州博日公司）在CFX96TM Real-Time system型熒光定量聚合酶鏈反應分析儀（美國BIO-RAD公司）上檢測樣本血漿中HIV-1 RNA，檢測范圍是80拷貝 /ml～ 1.8×108拷貝 /ml。

1.2.4 總HIV-1特異性抗體檢測 根據HIV-1抗體診斷試劑盒（萬泰生物，北京）說明書采用酶聯免疫吸附試驗對總HIV-1特異性抗體水平進行檢測，在450 nm波長處，使用酶標儀讀取不同孔的吸光度（OD）值，用OD值表示總HIV-1特異性抗體水平。

1.2.5 p24抗體定量檢測 采用熒光素酶免疫吸附試驗對p24抗體進行定量檢測[15]：使用磷酸鹽緩沖液（濃度0.01 mol/L，pH7.5）將G蛋白（Genscript，中國）稀釋成5 μg/ml后，包被在96孔白色微孔板（Corning，美國）上，并在4 ℃下孵育12 h；然后用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗板后加入5%的脫脂牛奶，在37 ℃下封閉1 h；洗滌后每孔加入100 μl的血清樣品（2%脫脂牛奶1∶100稀釋），并于37℃下孵育1 h；再次洗滌后每孔加入50 μl熒光素p24抗原裂解上清液（2%脫脂牛奶1:1000稀釋），并在37 ℃下孵育30 min。最后每孔加入50 μl的Nano-Glo熒光素酶檢測試劑，并根據說明書讀取熒光值（LU）。

1.2.6 總HIV-1 DNA和CA-RNA的定量檢測 用QIAamp DNA Mini 試劑盒（Qiagen，德國）和HiPure Total RNA Plus Mini 試劑盒（Magen，中國廣州）分別從PBMCs中提取細胞中總的DNA和RNA。用HIV-1 DNA定量檢測試劑盒（SUPBIO，中國廣州）和CA-RNA定量檢測試劑盒（SUPBIO，中國廣州）分別定量檢測總HIV-1 DNA和CARNA。定量范圍是10拷貝/106PBMC～5×106拷貝/106PBMC，檢測結果以對數形式表示。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。計量資料根據需要采用±s或四分位數表示。各時間點與基線比較采用自身配對t檢驗。相關性分析采用Pearson相關性分析。P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 基本信息 27例患者中，男性26例，女性1例，HIV-1感染者開始接受ART時的年齡是（39.8±11.91）歲。接受3TC+NVP+AZT治療的患者14例，接受3TC+AZT+EFV治療的患者7例，接受3TC+EFV+TDF治療的患者5例，接受3TC+NVP+TDF治療的患者1例。詳見表 1。

表1 27例患者基本信息Table 1 Basic information of 27 patients

2.2 長期ART過程中總HIV-1特異性抗體、p24抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平的變化 27例HIV-1感染者在ART 0、1、3、5年時p24抗體水平分別為2.450（1.910～5.460）、1.460（1.080～2.160）、1.280（1.120～ 1.800）、1.570（1.090～ 2.180）LU。隨著ART時間的增加p24抗體水平呈逐漸降低的趨勢，且在ART 1、3、5年時與基線進行比較，差異均有統計學意義（P 均＜0.05）（圖1 A）。總HIV-1特異性抗體水平分別為3.378（3.157～3.710）、3.489（3.237～3.622）、3.446（2.742～ 3.573）、3.336（2.860～ 3.566）， 在ART期間沒有發生顯著變化（P 均＞ 0.05）（圖1 B）?？侶IV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 0年時分別為3.580（3.200～3.750）和3.540（3.352～4.020）log10拷貝/106PBMC，ART 1年后水平均顯著下降，分別為3.060（2.790～3.280）和2.790（2.510～3.310）log10拷貝/106PBMC，隨后水平保持相對穩定，且在ART 1、3、5年時的總HIV-1 DNA和CA-RNA水平與基線分別進行比較，差異均有統計學意義（P均＜ 0.05）（圖 1 C～D）。

圖1 長期ART過程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體、總HIV-1 DNA和CA-RNA水平的變化Figure 1 Changes in p24 antibodies, total HIV-1 specific antibodies, total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during long-term ART

2.3 長期ART過程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平和總HIV-1 DNA、CA-RNA水平相關性分析 結果顯示，p24抗體水平與總HIV-1 DNA和CARNA水平均呈正相關（P 均＜ 0.05）（圖2 A～B）。而總HIV-1特異性抗體水平與總HIV-1 DNA和CARNA水平均沒有相關性（P 均＞ 0.05）（圖2 C～D）。

圖2 ART過程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平和總HIV-1 DNA、CA-RNA水平的相關性Figure 2 Correlations between p24 antibodies and total HIV-1 specific antibodies levels and total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during ART

3 討 論

近年來，AIDS功能性治愈是全球研究的熱點話題。所謂功能性治愈，是指中斷ART后，AIDS患者血漿中的HIV-1 RNA持續低于檢測下限，CD4+T細胞的數量和機體的免疫功能保持正常[16]。HIV-1儲存庫是目前AIDS功能性治愈的最大障礙，要想實現徹底清除HIV-1儲存庫這一目標，測量其大小顯得尤為重要。目前有關HIV-1特異性抗體水平與HIV-1儲存庫大小關系的研究結果存在爭議，限制了對AIDS功能性治愈的評估。本研究擬對不同HIV-1特異性抗體與HIV-1儲存庫之間的關系進行探討，為AIDS功能性治愈的評估提供借鑒。

本研究發現在長期ART過程中，總HIV-1特異性抗體水平沒有發生明顯的變化，而p24抗體水平隨著ART時間的增加呈逐漸降低的趨勢。p24是HIV-1的衣殼蛋白，在HIV-1的復制過程中發揮重要作用。因此p24抗體是HIV-1診斷以及檢測疾病進展的重要指標。關于ART導致p24抗體水平的降低，目前普遍觀點認為是由于ART抑制了HIV-1的復制從而使抗原刺激缺乏導致的體液免疫缺陷[17-18]。另外，有研究發現HIV-1儲存庫建立的早晚也會影響ART期間HIV-1抗體的水平[19]。在急性HIV-1感染期間接受ART可能會限制HIV-1儲存庫的形成，并阻止HIV-1抗體反應。然而，在慢性HIV-1感染期間，HIV-1儲存庫已經建立起來，ART無法將其徹底清除，將會產生持續不斷的抗原刺激。本研究中的HIV-1感染者在確診感染至少1個月以上才開始接受ART，此時感染者體內有持續不斷的抗原刺激機體維持一定的HIV-1抗體水平。這可能是本研究中總HIV-1特異性抗體水平在ART期間沒有發生明顯變化的原因。

本研究對長期ART過程中p24抗體、總HIV-1特異性抗體水平與HIV-1儲存庫大小之間的關系進行了探討。結果發現，總HIV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 1年后都顯著下降，隨后水平保持相對穩定，與p24抗體水平的變化趨勢一致。經過相關性分析發現長期ART過程中總HIV-1 DNA和CA-RNA水平與p24抗體水平均呈正相關。以上結果表明，p24抗體水平與HIV-1儲存庫大小有關，p24抗體的水平可以區分儲存庫大小，與Burbelo等[11]研究結果一致。而夏陽等[20]的研究對52例HIV-1感染者的總HIV-1 DNA水平以及p24抗體水平進行相關性分析，結果發現總HIV-1 DNA水平與p24抗體水平之間沒有相關性。以上結果不一致可能是患者差異所導致，包括治療方案的差異、病毒亞群差異及隨訪時間點差異。另外，本研究發現總HIV-1特異性抗體水平與總HIV-1 DNA 和CA-RNA沒有相關性，不能評估HIV-1儲存庫大小。而有研究對柏林病人干細胞移植前后的抗體水平進行蛋白質印跡法分析，結果顯示移植后柏林病人中仍可檢測到針對包膜蛋白的抗體，但針對核衣殼蛋白和聚合酶的抗體含量明顯下降[21]。以上研究表明不同HIV-1特異性抗體與HIV-1儲存庫大小的關系不一致，為HIV-1特異性抗體水平和HIV-1儲存庫大小關系的研究提供了指導。

綜上所述，總HIV-1特異性抗體水平隨著ART時間的增加沒有明顯變化，且與總HIV-1 DNA和CA-RNA水平沒有相關性；p24抗體水平隨著ART 時間的增加呈逐漸下降趨勢，且與總HIV-1 DNA以及CA-RNA水平均呈正相關關系。由此可見，患者體內p24抗體水平具有評估其HIV-1儲存庫大小的臨床價值，值得進一步推廣。但本研究存在一定的局限性，研究樣本量較少，縱向觀察時間較短（5年），該結論還須擴大樣本量并延長隨訪年限加以進一步驗證。