活動性肺結核免疫耗竭及免疫治療的研究進展

彭 濤，如克亞木·阿不都沙拉木，房 珂，宋維維，丁萌譞，謝 娜，舒占鈞

結核病是慢性感染性疾病，目前以抗結核藥物治療為主。而機體的免疫功能對結核病患者病情的發展至關重要，抗結核治療的效果以及后期復發與否與患者免疫功能的強弱關系密切。在活動性肺結核患者的疾病進程中，結核分枝桿菌（結核桿菌）長期刺激宿主的免疫細胞可導致這些免疫細胞功能耗竭，在免疫耗竭的狀態下宿主免疫細胞不能對結核桿菌產生有效的免疫應答，從而使結核桿菌不斷增殖，導致在某些時候單純采用抗結核藥物治療的難度增大。胸腺肽和細胞因子可以增強T細胞對結核桿菌的免疫應答，過繼免疫細胞治療通過外源性補充免疫細胞的方式提高患者的細胞免疫應答，從而以輔助治療的方式改善免疫耗竭的狀況，使結核桿菌能被更好的清除。

1 免疫耗竭的概念及表現

“免疫耗竭”是用來描述當免疫細胞在受到高劑量抗原持續刺激的情況下所導致的一種免疫細胞功能受損的狀態。該詞的由來可以追溯到20世紀60～70年代。正常的效應T細胞通常會在病原體被清除、炎癥被消除后死亡或分化為記憶T細胞。但20世紀90年代Zajac等[1]在感染淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒的小鼠體內發現了某種特殊表型的CD8+T細胞，這種CD8+T細胞可以持續存在但不具備正常的抗病毒的免疫效應，即不能激發其正常的細胞毒性和有效產生IFN-γ，這些CD8+T細胞似乎在進行一種持續而無效的努力。這種特殊的狀態被稱為“免疫耗竭”，CD8+T細胞的免疫耗竭可以看成是分化為記憶CD8+T細胞的程序發生了改變[2]。

現以CD8+T細胞舉例說明免疫耗竭的表現。與正常的效應CD8+T細胞以及正常的記憶CD8+T細胞相比，耗竭的CD8+T細胞存在許多不同之處，主要表現在以下幾個方面。第一，免疫效應功能逐步受損[3]。開始首先是IL-2的產生減少，然后產生減少的是TNF，到了CD8+T細胞嚴重耗竭階段的時候IFN-γ的產生減少[4]。第二，多種抑制性受體（inhibitory receptors, IRs）上調并且持續表達[5]。這些IRs本來功能是為了防止免疫應答進行過度而引起病理性免疫反應或自身免疫反應，但是其過度持續地表達會抑制CD8+T細胞的免疫功能。這些抑制性受體主要有：程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）、淋巴細胞活化基因3、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、T細胞免疫球蛋白粘液素結合區域3（T cell immunoglobulin mucin 3 polypeptide N terminal,TIM-3）、含Ig及免疫受體酪氨酸抑制基序結構域的T細胞免疫受體等，目前對PD-1的研究較多。第三，增殖能力的改變[6]。正常情況下通過IL-7和IL-15的介導，正常的記憶CD8+T細胞可以進行穩態增殖，具有不依賴抗原而實現自我更新的特性，而耗竭的CD8+T細胞由于信號通路的缺陷，不具備這種特性，它是通過抗原信號來維持其持續增殖[7-8]（見圖1）。第四，細胞代謝的改變。由于PD-1抑制磷酸肌醇3激酶和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，直接影響代謝途徑的信號，導致耗竭的CD8+T細胞對葡萄糖的攝取減少和線粒體能量代謝失調[9]。第五，轉錄調節因子和表觀遺傳學的改變。耗竭的CD8+T細胞具有和正常的記憶CD8+T細胞不同的轉錄程序[10]。

圖1 T細胞耗竭示意圖[7]Figure 1 Schematic diagram of T cell exhaustion[7]

除了CD8+T細胞之外，CD4+T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞均可發生類似的免疫耗竭。

2 活動性肺結核與免疫耗竭

肺結核是一種慢性傳染病，由結核桿菌感染引起，是最嚴重的傳染病之一。機體免疫力的強弱與結核病的發展密切相關，固有免疫和適應性免疫均參與到了抗結核感染當中。

固有免疫是機體抵抗結核桿菌感染的第一道防線。包括巨噬細胞、樹突狀細胞（dentritic cell,DC）、中性粒細胞和NK細胞在內的固有免疫細胞可以通過多種模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別結核桿菌。PRRs再啟動與固有免疫防御相關的多種細胞功能，包括吞噬、細胞凋亡、自噬、炎性小體的激活[11]。而結核桿菌也可以通過多種機制逃避機體的固有免疫，例如細胞溶質的逃逸，抑制抗菌肽的產生，抑制吞噬體成熟，抑制細胞凋亡，抑制自噬作用，抑制炎性小體激活[12]。

機體抗結核免疫效應的正常發揮還依賴于適應性免疫中的細胞免疫。由于結核桿菌是胞內寄生菌，而由CD4+T細胞分化的Th1分泌的IFN-γ可促進巨噬細胞產生大量活性氧中介物和活性氮中介物殺傷其已吞噬的結核桿菌。而且Th1還能輔助CD8+T細胞的增殖分化，促使CD8+T細胞也分泌IFN-γ來激活巨噬細胞殺滅其已吞噬的結核桿菌，或者使CD8+T 細胞直接通過釋放顆粒酶、穿孔素導致感染結核桿菌的巨噬細胞被溶解，從而殺死巨噬細胞內的結核桿菌[13]。所以，在抗結核桿菌感染的過程中，CD4+T細胞發揮著重要的作用[14]。

Roberts等[15]的研究發現，相比于對照組，涂陽肺結核患者體內Th1內的IFN-γ減少，并且在應對卡介苗刺激的應答過程中，叉頭狀家族轉錄因子FOXP3、TNF-β和IL-4 mRNA的表達增加，暗示著這組患者出現了免疫抑制。Jayaraman等[16]的研究表明，在感染早期，結核桿菌特異性的CD4+T細胞還能夠分泌一些IFN-γ、IL-2和TNF，可是隨著感染進展，這些結核桿菌特異性CD4+T細胞產生的IL-2減少，產生TNF的能力也逐漸下降，并且表達多種抑制性受體。Day等[17]的研究發現，與潛伏性結核感染者相比，活動性結核病患者體內結核桿菌特異性CD4+T細胞的增殖能力嚴重下降。這些都提示CD4+T細胞功能出現障礙，進入了免疫耗竭。由于處于免疫耗竭狀態的CD4+T細胞不能有效地介導抗結核桿菌的適應性免疫應答，導致結核桿菌不斷增殖，進而造成結核病的不斷進展。

CD8+T細胞對于控制結核桿菌感染也非常重要。和CD4+T細胞一樣，CD8+T細胞也能夠產生一些與抗結核桿菌感染相關的重要細胞因子，如TNF、IL-2和IFN-γ[18]。有研究發現，小鼠慢性感染時CD8+T細胞的減少導致結核桿菌數量增加，表明CD8+T細胞對于控制結核感染是必要的[19]。但是Day等[20]通過結核桿菌慢性感染的小鼠模型研究發現，在抗結核免疫中結核桿菌特異性CD8+T細胞的多功能活性減弱，其增殖能力也有所下降，TNF-α、IL-2和IFN-γ的生成也有減少。并且其在后續的研究中還發現，在結核桿菌慢性感染的小鼠模型以及活動性結核病患者體內，抑制性受體在CD8+T細胞上的表達增高[17]。這些都表明CD8+T細胞出現了免疫耗竭。處于耗竭狀態的CD8+T細胞不能有效地參與對抗結核桿菌的免疫應答，會出現細胞毒性功能受損[21]，即顆粒酶和穿孔素等細胞毒性分子的產生減少[22]，不能很好地殺傷被結核桿菌感染的靶細胞，從而導致結核桿菌在體內的載量不斷升高。

3 免疫治療

3.1 肺結核難治的原因 當抗結核藥物把結核桿菌清除后，免疫細胞受到結核桿菌持續刺激的狀況得到解除，免疫耗竭也就得到改善。然而，單純依賴抗結核藥物治療活動性肺結核存在很多困難。朱培福等[23]認為，年齡大、生理功能減弱、同時合并嚴重的基礎疾病、肺組織結核空洞的形成以及外周淋巴細胞出現明顯的調亡，致使患者免疫功能下降，是導致肺結核難治的主要原因。當然，其他原因還有結核桿菌耐藥、患者服藥依從性差、醫療機構新的有效抗結核藥物品種不足等。這些原因使得體內結核桿菌載量居高不下，持續地刺激機體免疫細胞，導致免疫細胞耗竭，耗竭的免疫細胞不能發揮有效的抗結核免疫應答，并且還使得結核肉芽腫的形成不典型，不能將結核桿菌的感染局限化[24]，從而又使體內的結核桿菌載量進一步增加，形成惡性循環。所以，免疫耗竭可能是導致肺結核發病以及難治的機制之一。

3.2 胸腺肽治療 胸腺肽是從動物胸腺組織提取的一組可溶性的多肽混合物，可輔助T細胞的發育，增強T細胞對抗原的免疫應答，常用于輔助治療臨床上各種免疫功能降低的疾病，臨床常用的主要有胸腺五肽和胸腺素α1。任萍[25]的臨床研究顯示，在常規抗結核治療的同時，加用胸腺肽治療，CD3+T細胞、CD4+/CD8+水平的提升幅度會比單純采用抗結核藥物治療更大。Liu等[26]的回顧性研究發現，胸腺素α1輔助治療能降低患者耗竭CD8+T細胞上抑制性受體Tim-3和PD-1的表達，使嚴重T細胞減少患者的CD8+T細胞和CD4+T細胞數量得以恢復，逆轉T細胞的耗竭，從而降低了病死率。孫瑩等[27]通過Meta分析發現，胸腺肽聯合基礎抗結核藥物治療患者的病灶吸收率、肺空洞縮小及閉合率、3個月痰培養轉陰率方面均優于單用基礎抗結核藥治療患者。所以，胸腺肽也許可作為一種輔助治療的方式改善活動性肺結核患者的T細胞耗竭。

3.3 細胞因子治療 被用于結核病輔助治療研究的一些常用細胞因子主要有IFN-γ、IL-2、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF） 等。20世 紀90年代，Raad等[28]在1例耐多藥的腦和脊髓結核患者使用過6種抗結核藥物治療無明顯效果后，對其使用IFN-γ與粒細胞集落刺激因子聯合輔助治療，治療5個月時，患者的神經系統實質以及影像學方面出現了明顯的改善，持續治療12個月時，大腦和脊髓病變完全消失。Gao等[29]的系統綜述中，IFN-γ輔助治療，尤其是氣霧劑治療，可能對結核病患者有益。但是劉其會等[30]認為，IFN-γ輔助治療的臨床效果不是很理想，持續時間短暫。T細胞耗竭時，IFN-γ是其所缺乏的重要細胞因子，結合上述分析，使用IFN-γ輔助治療可能會對結核病患者T細胞耗竭有所改善，但是近年來關于IFN-γ治療結核病的相關研究較少，還需要多中心的大規模的臨床試驗來對其安全性和療效進行評估。

IL-2也是結核病細胞因子輔助治療研究中的常用細胞因子之一。Zhang等[31]的Meta分析顯示，IL-2的輔助免疫治療可以促進結核病患者CD4+T細胞和NK細胞的增殖和分化，改善宿主免疫功能，還可以提高耐多藥結核病患者痰涂片和痰培養的轉陰率，從而控制肺結核病情的進展，但對結核病患者的胸部影像學并沒有明顯的改善。

GM-CSF最初被定義為造血生長因子，因為它能促使骨髓祖細胞增殖和分化形成粒細胞和巨噬細胞集落[32]。作為重要抗原提呈細胞的DC也屬于髓系細胞，GM-CSF對于DC的增殖和成熟來說至關重要。Chuang等[33]創造了一種新型白蛋白融合GM-CSF的分子，它能增加結核病小鼠的肺和引流淋巴結內DC的數量，增加抗原的提呈，從而使T細胞介導的免疫應答能被有效地激活，改善T細胞耗竭，降低小鼠體內的結核桿菌載量，具有一定應用前景。張雍容等[34]的小鼠模型試驗表明，當IL-2或GM-CSF其中之一與抗結核藥物聯合治療時，在抑菌率上并沒有表現出明顯的優勢，但是小鼠肺組織的病理損傷有明顯的減弱。然而相比于單純采用抗結核藥物治療，IL-2和GM-CSF共同參與的輔助免疫治療聯合抗結核藥物治療不僅能減少肺部損傷，還能更有效地提高抑菌率，而且還能比其他治療組在提高小鼠存活率上有明顯優勢。所以，多種細胞因子聯合使用應該可以作為在抗結核藥物基礎上輔助治療活動性肺結核免疫耗竭的策略之一。

3.4 過繼免疫細胞治療 過繼免疫細胞治療是一種將自體或異體的免疫細胞在體外用細胞因子激活、擴增后再輸給患者，從而直接殺傷抗原的被動免疫治療。Xu等[35]報道了1例將細胞因子誘導的殺傷性細胞（cytokine-induced killer, CIK）過繼免疫細胞療法聯合二線抗結核藥物用于耐多藥結核病患者治療的個案，顯示出了較好的療效。唐佩軍[13]的一項關于CIK聯合抗結核藥物治療的隨機對照試驗顯示，CIK與抗結核藥物聯合使用可以明顯緩解耐多藥肺結核患者的呼吸道癥狀、痰檢情況以及肺部病灶的吸收情況。Zhao等[36]的Meta分析顯示，細胞治療具有較好的安全性。Ramos-Espinosa等[37]也表示有證據支持其有效性和安全性。活動性肺結核患者處于免疫耗竭時，體內耗竭的免疫細胞不能對結核桿菌產生有效的免疫應答，所以將免疫細胞經體外擴增后再回輸給患者，以補充體內細胞免疫應答的不足，不失為一種有效的策略。

4 結 論

活動性肺結核患者體內的結核桿菌長期持續地刺激免疫細胞可引起免疫耗竭，處于免疫耗竭狀態下的免疫細胞難以像正常的免疫細胞那樣對結核桿菌發揮有效的免疫應答，使患者體內的結核桿菌載量不斷升高，導致在某些時候單純地使用抗結核藥物治療變得困難，從而容易使結核病不斷進展。免疫耗竭可能是導致肺結核發病以及難治的機制之一。

胸腺肽和細胞因子可以增強T細胞對結核桿菌的免疫應答，過繼免疫細胞治療通過外源性補充免疫細胞的方式提高患者的細胞免疫應答，從而以輔助治療的方式改善免疫耗竭。所以，抗結核藥物治療與多種免疫治療的聯合應用也許是未來治療活動性肺結核患者免疫耗竭的有效手段。