酪蛋白抗凝血肽的分離純化及其抗凝血活性測(cè)定

劉麗莎，苗艷麗,陳紹紅,張劉，盧曉

(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)，又稱(chēng)循環(huán)系統(tǒng)疾病，這類(lèi)疾病居全球死亡率首位，預(yù)計(jì)到2030年將會(huì)有超過(guò)2 360萬(wàn)人死于心血管疾病[1-2]。血栓類(lèi)疾病是典型的心血管疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及并發(fā)癥多等特點(diǎn)。抗凝治療是預(yù)防和治療血栓類(lèi)疾病的主要手段，目前用于治療該類(lèi)疾病的藥物有很多，主要有肝素、華法林及阿加曲班等，但這些藥物都存在一定的副作用，例如引起血小板減少、出血及骨質(zhì)疏松等，有待進(jìn)一步發(fā)展與完善。

目前，一些食源性蛋白水解、發(fā)酵等產(chǎn)物已被證實(shí)具有抗凝血活性，如魚(yú)皮蛋白水解物[3]、豆類(lèi)蛋白水解物[4]、酪蛋白水解物[5]及貽貝、魚(yú)肉蛋白水解物[6-7]等，部分活性肽結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析。進(jìn)而，從食物源中深入研究開(kāi)發(fā)具有抗凝血功能的肽類(lèi)具有廣泛的前景。同時(shí)，食源性生物活性肽憑借其吸收性好[8]、副作用小[9]等優(yōu)點(diǎn)日益受到研究者的重視，其主要來(lái)源為乳類(lèi)蛋白，蛋清蛋白及水產(chǎn)蛋白等。

本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為原料，通過(guò)菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶4種酶復(fù)合酶解酪蛋白獲得具有抗凝血活性的小肽[10]，然后采用超濾法初步分離得到純度較高的抗凝血肽，并利用凝膠色譜法確定其分子量分布。本研究目的在于，以酪蛋白為原料來(lái)制備酪蛋白抗凝血肽，研發(fā)能夠防治血栓性疾病的食源性生物活性肽類(lèi)藥物或具有保健功能的食品，并為這方面的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

新西蘭大白兔，兩只，雌雄各半，普通級(jí)，質(zhì)量2.3～2.5 kg,廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)證號(hào):SCXX(粵)2017-0035。酪蛋白(上海源葉生物科技有限公司)；胰蛋白酶250 U·mg-1、木瓜蛋白酶800 U·mg-1、菠蘿蛋白酶300 U·mg-1、中性蛋白酶100 U·mg-1(上海源葉生物科技有限公司);凝血酶(1 000 U/瓶，上海源葉生物科技有限公司)；纖維蛋白原(牛血纖維蛋白原，美國(guó)Biosharp公司)；鹽酸(廣州化學(xué)試劑二廠)；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉(廣州化學(xué)試劑二廠)；其他試劑均為分析純。

恒溫水浴振蕩器(沈陽(yáng)萊克斯儀器制造有限公司)；恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；AE觸摸式彩屏電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；3H2ORI智能高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；P4型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限責(zé)任公司)；Waters 1525高效液相色譜儀(重慶偉琪儀器有限公司)；pH計(jì)；MIcroposep Advance離心濃縮管；10 mL和100 mL移液槍等。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 酪蛋白酶解液的制備 吳雄等[10]用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法酶解酪蛋白，得到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶四酶復(fù)合酶解酪蛋白的工藝條件。本研究選取表1中4種最佳方案分別對(duì)酪蛋白進(jìn)行復(fù)合酶解和混合酶解。稱(chēng)量4.0 g酪蛋白,料水比為1∶7(m/V)，反應(yīng)體系pH為7.0；根據(jù)文獻(xiàn)4種蛋白酶混合酶解溫度設(shè)置為50 ℃；按照每種酶的最適酶用量，加入適量菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶[10]，在50 ℃水解3 h；水解結(jié)束，滅活后冷卻至室溫，以5 000 r·min-1離心10 min。剩下的3個(gè)組合的混合酶解以同樣的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

復(fù)合酶解步驟為：取一份酪蛋白溶液，加入一定量的菠蘿蛋白酶，在pH為7.0、60 ℃條件下水解3 h，取出滅活后冷卻至常溫；然后加入適量胰蛋白酶，50 ℃水解3 h，滅活后冷卻至常溫；再加入適量中性蛋白酶，50 ℃水解3 h，滅活后冷卻至常溫；放入離心機(jī)中以5 000 r·min-1離心10 min[10]。其余組合同以上步驟。

2.2 抗凝血活性的測(cè)定 酶水解物的活力用 ATU 表示，測(cè)定方法為凝血酶滴定改進(jìn)法[11]。測(cè)得4個(gè)組合混合酶解和復(fù)合酶解的抗凝血活性如表1。

表1 混合酶解和復(fù)合酶解抗凝血活性

從數(shù)據(jù)可知“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”組合復(fù)合酶解抗凝血活性最高，為100.0 ATU·mL-1，“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶”混合酶解抗凝血活性較低，為90.0 ATU·mL-1。選擇抗凝血活性最高的四酶“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”復(fù)合酶解液作為樣品Ⅰ進(jìn)行分離純化。

2.3 超濾法分離抗凝血肽 樣品Ⅰ采用截留分子量為1 kD、3 kD的超濾離心管設(shè)置轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1，離心30 min，離心結(jié)束輕輕取出溶液，獲得4個(gè)組分：截留分子量1 kD濃縮液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)1 kD濃縮液)、截留分子量3 kD濃縮液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)3 kD濃縮液)；截留分子量為3 kD濾過(guò)液和1 kD濾過(guò)液 (濾過(guò)液指透過(guò)超濾膜留在外管的溶液，濃縮液指留在超濾膜以?xún)?nèi)的溶液)。測(cè)定其抗凝血活性，具體數(shù)據(jù)如表2。

表2 超濾酶解液的抗凝血活性

樣品Ⅰ經(jīng)過(guò)超濾， 1 kD濃縮液和3 kD濃縮液的抗凝血活性分別為75 ATU·mL-1和50 ATU·mL-1；3 kD和1 kD濾過(guò)液的抗凝血活性分別為30 ATU·mL-1和15 ATU·mL-1。兩種濾過(guò)液抗凝血活性較低，故不考慮繼續(xù)進(jìn)行純化；選擇1 kD濃縮液和3 kD濃縮液測(cè)定其體外溶栓和抗凝血實(shí)驗(yàn)；對(duì)1 kD濃縮液進(jìn)行純化。

2.4 體外溶栓和抗凝血實(shí)驗(yàn)

2.4.1 體外抗凝血實(shí)驗(yàn) 體外抗凝血實(shí)驗(yàn)參考[12]，兔耳后采血，待血液未凝固，取5支試管，編號(hào)，一號(hào)管加入兔血2.0 mL，二號(hào)管-兔血∶4%檸檬酸鈉溶液(V∶V)=1∶1，三號(hào)管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=9∶1，四號(hào)管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=6∶4，五號(hào)管-兔血∶1 kD濃縮液(V∶V)=1∶1。將五只試管放入水浴鍋中于37 ℃水浴3 min，觀察血液凝固時(shí)間。3 kD濃縮液同以上方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1 kD濃縮液一號(hào)管兔血1min凝固，二號(hào)管48 h后凝固，三號(hào)管30 min后凝固;四號(hào)管48 h后沒(méi)有凝固。五號(hào)管48 h后沒(méi)有凝固。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過(guò)截留分子量為1 kD的超濾膜的酪蛋白酶解液具有抗凝血作用。圖1(1)～(5)分別為1 kD濃縮液一號(hào)管、二號(hào)管、三號(hào)管、四號(hào)管和五號(hào)管血液凝固情況。

圖1 1 kD濃縮液抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 kD濃縮液一號(hào)管兔血1 min凝固，二號(hào)管48 h后凝固，三號(hào)管30 min后凝固;四號(hào)管48 h后沒(méi)有凝固。五號(hào)管48 h后沒(méi)有凝固。實(shí)驗(yàn)表明3 kD濃縮液具有抗凝血作用。圖2(1)～(5)分別為3 kD濃縮液一號(hào)管、二號(hào)管、三號(hào)管、四號(hào)管和五號(hào)管血液凝固情況。

圖2 3 kD濃縮液抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 體外溶栓實(shí)驗(yàn) 將兔血倒在培養(yǎng)皿中，取一段棉線(xiàn)浸泡在兔血中，待血液凝固后將棉線(xiàn)剪成3～4 cm小段，一段浸泡在樣品溶液中，一段浸泡在生理鹽水中，將兩份溶液于37 ℃下靜置24 h，觀察溶液與棉線(xiàn)狀態(tài)，拍照保存。結(jié)果如圖3所示。

圖3 1 kD、3 kD濃縮液體外溶栓實(shí)驗(yàn)

圖3中(a)、(d)分別是血栓條開(kāi)始放進(jìn)生理鹽水中和24 h后中的狀態(tài)，(b)、(e)分別是血栓條放進(jìn)1 kD濃縮液和24 h后的狀態(tài)，(c)、(f)血栓條放進(jìn)3 kD濃縮液和 24 h后的狀態(tài)，圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血栓條在1 kD濃縮液和3 kD濃縮液中24 h后均由紅色變成白色，由此得出1 kD、3 kD濃縮液具有體外溶栓作用。

2.5 凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定肽分子量分布

2.5.1 GPC研究測(cè)定分子量分布研究[13]

2.5.1.1 脫鹽 選擇1 kD的透析袋。將透析袋剪成大約15 cm的小段，取一個(gè)500 mL大燒杯，加入適量2%碳酸氫鈉和pH為8.0的1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，透析袋放入燒杯中煮沸10 min，取出后用蒸餾水清洗透析袋。

將適量1 kD超濾濃縮液裝入透析袋中，取500 mL大燒杯加入蒸餾水，將樣品溶液置于冰箱中透析，每隔3 h換水，直至大燒杯中不能檢出氯離子。透析后的樣品溶液作為樣品Ⅱ。

2.5.1.2 色譜條件 色譜柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)；檢測(cè)：UV 220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃

2.5.1.3 標(biāo)樣配制 稱(chēng)取細(xì)胞色素C(MW12400)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相溶解配制成0.2 mg·mL-1左右的標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液。

2.5.1.4 樣品制備 稱(chēng)取樣品Ⅱ100 mg于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，使用0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。

2.5.2 數(shù)據(jù)處理 樣品Ⅱ溶液在上述色譜條件下分析，用GPC軟件處理數(shù)據(jù)，得到樣品Ⅱ中肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布和其分布范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品Ⅱ中肽相對(duì)分子量分布情況

樣品Ⅱ的分子量分布如表3所示，綜合圖4和表3中的結(jié)果，可得出分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范圍，分子量小于1 000的占76.09%，樣品總重均分子量為1 398。

圖4 樣品Ⅱ分子量譜圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用“菠蘿蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”組合復(fù)合酶解液進(jìn)行超濾，截留分子量1 kD濃縮液抗凝血活性最高，為75 ATU·mL-1；截留分子量為3 kD濃縮液抗凝血活性為50 ATU·mL-1。選用3 kD濃縮液、1 kD濃縮液進(jìn)行體外溶栓和抗凝血實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明3 kD濃縮液、1 kD濃縮液具有較好的體外溶栓和抗凝血作用。對(duì)脫鹽的1 kD超濾濃縮液進(jìn)行分子量分布測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范圍，分子量小于1 000的占76.09%。后續(xù)有關(guān)1 kD超濾濃縮液的進(jìn)一步分離及一級(jí)結(jié)構(gòu)研究正在進(jìn)行中。