甘藍強骨片急性毒性和長期毒性試驗

周澤璇,張婷，梁國棟，劉衛東，肖云峰

(1.內蒙古大唐藥業股份有限公司，內蒙古自治區 呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區蒙藥新藥研發企業重點實驗室，內蒙古自治區 呼和浩特 010010；3.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，內蒙古自治區 呼和浩特 010010)

藍刺頭是菊科植物多年生草本，以頭狀花序入藥，屬蒙醫藥常用傳統蒙藥材之一，最早記載于蒙古族著作《智慧之鑒》中，性味苦，涼，具有固骨質，接骨愈傷，清熱止痛的功效，主要用于骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍等病癥[1]。甘藍強骨片是由本公司研發中心自主研發的一味特色蒙藥，由藍刺頭、甘草、桑白皮三位味道地蒙藥材組成，具有補脾益氣、清熱解毒、瀉肺平喘、利水消腫、固骨質、清熱止痛等功效，主要用于肝腎虧損之圍絕經期、絕經期骨質疏松，尤其是對骨質疏松有一定的治療效果，擁有良好的應用前景。

上市的藥品必須具備安全、有效和質量可控三個條件[2]，其中藥品的安全性關乎于人們的生命健康是重中之重，因此在藥品上市之前必須通過毒性研究試驗對藥品的安全性做出評價。依據毒性研究技術指導原則[3-6]，本文通過開展甘藍強骨片的急性毒性和長期毒性試驗研究，觀察動物產生的毒性反應及嚴重程度，對主要毒性反應靶器官的損害，評價甘藍強骨片用藥安全性，確定安全劑量，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物與飼養條件

1.1.1 動物 SPF級昆明種小鼠和SPF級Wistar種大鼠，均由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證編號均為SCXK(蒙)2015-0001，使用許可證編號均為SYXK(蒙)2015-0001。購入后檢疫適應環境7 d，并對動物外觀健康、臨床癥狀等情況觀察，各項指標達到試驗要求。

1.1.2 環境條件 溫度20～26 ℃，日溫差≤3 ℃；相對濕度41%～64%；換氣次數≥15 次/h；照明時間12 h/12 h(07∶30～19∶30)明暗交替，照度150～300 Lux。

1.2 藥品與試劑 甘藍強骨片(內蒙古大唐藥業股份有限公司生，批號：20200324)；水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠，批號：20181124)；羧甲基纖維素鈉(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na，天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20190304)；血細胞分析試劑(深圳邁瑞生物股份有限公司，批號：2019030106)；谷丙轉氨酶(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191013563)；谷草轉氨酶(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200114305)；白蛋白(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：190923316)；總蛋白(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200119101)；尿素(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191201352)；肌酐(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191222511)；葡萄糖(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191107307)；總膽固醇(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191007278)；甘油三酯(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200119117)。

1.3 儀器 電子天平(北京塞多利斯儀器系統有限公司，型號：BS2202S、BS2402S)；實體解剖顯微鏡(德國Leica公司，型號：DFC 290)；封閉式全自動組織脫水機(德國徠卡，型號：ASP 200)；切片機(德國徠卡，型號： RM 2235)；自動染色機(德國徠卡，型號：AUTOSTAINER XL)；分體式組織包埋機(德國徠卡，型號：EG 1150 H)；烘片機(德國徠卡，型號：HI 1220)；攤片機(德國徠卡，型號：HI 1210)；倒置顯微鏡(德國徠卡，型號：DM3000)；全自動生化分析儀(愛爾蘭藍寶石公司，型號：ADS 600)；全自動血液細胞分析儀(希森美康集團，型號：Sysmex XT-1800i)。

2 實驗方法

2.1 單次給藥試驗

2.1.1 動物分組與給藥劑量 選取健康昆明種小鼠40只，適應性飼養7 d后，按性別、體重將小鼠隨機分為溶劑對照組(0.5%CMC-Na)和供試品組(甘藍強骨片)，每組20只，雌雄各半。根據藥物急性毒性預試驗，無法測出LD50，故采用急性毒性限度試驗測定方法。配制藥物最大可混懸濃度為0.847 1 g·mL-1，由于無臨床給藥劑量，采取單日內單次給予藥物最大濃度劑量，小鼠按0.4 mL/10 g灌胃給藥1次，總給藥體積為40 mL·kg-1，給藥劑量為33.86 g·(kg·d)-1。

2.1.2 觀察、稱重及檢查 給藥后觀察動物的臨床癥狀，連續觀察至第14天，每天對動物進行體重、攝食量、飲水量測定和記錄。第15天解剖動物，并進行大體病理學檢查，若發現病變，則對病變組織進行組織病理學檢查。

2.2 重復給藥試驗

2.2.1 動物分組與給藥劑量 選取Wistar大鼠80只，體重51.0～77.3 g，適應性飼養7 d后，按體重隨機分為4組，每組20只，雌雄各半。受試物按急性毒性試驗設計劑量設4個劑量組，分別為高劑量組[22.50 g·(kg·d)-1]、中劑量組[11.25 g·(kg·d)-1]、低劑量組[0.45 g·(kg·d)-1]和溶劑對照組(0.5%CMC-Na)。各組均以40.0 mL·(kg·d)-1灌胃(溶劑對照組灌胃等容量0.5%CMC-Na)，每天一次灌胃給予受試藥物，連續給藥30 d。

2.2.2 觀察、稱重及檢查 每天觀察并記錄動物的一般臨床癥狀，每周測定并記錄動物的體重及進食量。實驗第31天，腹主動脈取血測定血清生化指標和血象指標，然后進行大體解剖，觀察有無異常，取肝、腎、脾、睪丸等臟器稱重，并將溶劑對照組和高劑量組動物的肝、腎、脾、胃腸、睪丸(卵巢)等臟器固定，進行組織病理學檢查。

3 數據的統計與處理

4 結果

4.1 急性毒性試驗

4.1.1 對動物臨床癥狀的影響 給藥后連續觀察動物14 d，小鼠進食、進水、活動、毛色、糞便姿勢、軀體運動、呼吸頻率、下腹及肛門周圍無污染、眼、鼻、口無分泌物、體溫等一切正常。

4.1.2 對動物體重的影響 與溶劑對照組比較，供試品組雌雄小鼠體重未見明顯差異(P>0.05)，結果見表1～2。

表1 甘藍強骨片對小鼠體重的影響(♂,

表2 甘藍強骨片對小鼠體重的影響(♀,

4.1.3 對動物攝食量的影響 供試品組小鼠攝食量與溶劑對照組基本一致，未見明顯差異(P>0.05)，結果見表3～4。

表3 甘藍強骨片對小鼠攝食量的影響(♂,

表4 甘藍強骨片對小鼠攝食量的影響(♀,

4.1.4 對動物飲水量的影響 供試品組小鼠飲水量與溶劑對照組基本一致，未見明顯差異(P>0.05)，結果見表5～6。

表5 甘藍強骨片對小鼠飲水量的影響(♂,

4.1.5 病理學檢查 大體病理學檢查，肉眼觀察組織、器官未發現異常或病變。

表6 甘藍強骨片對小鼠飲水量的影響(♀,

4.2 長期毒性試驗

4.2.1 對動物臨床癥狀的影響 給藥后連續觀察動物2周，大鼠進食、進水、活動、毛色、糞便姿勢、軀體運動、呼吸頻率、下腹及肛門周圍有無污染、眼、鼻、口有無分泌物、體溫等一切正常。

4.2.2 對動物體重的影響 與溶劑對照組比較，供試品組大鼠體重未見明顯差異(P>0.05)，結果見表7～8。

表7 甘藍強骨片對大鼠體重的影響(♂,

表8 甘藍強骨片對大鼠體重的影響(♀,

4.2.3 對動物攝食量的影響 與溶劑對照組比較，供試品組大鼠攝食量無明顯差異(P>0.05)，結果見表9～10。

表9 甘藍強骨片對大鼠攝食量的影響(♂,

4.2.4 對大鼠血常規的影響 與溶劑對照組相比，供試品組大鼠血常規各指標未見明顯差異(P>0.05)，主要指標見表11～12。

表10 甘藍強骨片對大鼠攝食量的影響(♀,

表11 甘藍強骨片對大鼠血常規的影響(♂,

4.2.5 對大鼠生化指標的影響 與溶劑對照組相比，供試品組雄鼠肌酐及甘藍強骨片22.50 g·(kg·d)-1組總膽固醇均明顯低于溶劑對照組(P<0.05、P<0.01)，但無生物學意義。其余供試組與溶劑對照組基本一致，無明顯差異(P>0.05)，主要指標見表13～16。

表12 甘藍強骨片對大鼠血常規的影響(♀,

表13 甘藍強骨片對大鼠生化指標的影響(♂,

表14 甘藍強骨片對大鼠生化指標的影響(♀,

表15 甘藍強骨片對大鼠生化指標的影響(♂,

表16 甘藍強骨片對大鼠生化指標的影響(♀,

4.2.3 病理學檢查

4.2.3.1 大體解剖觀察 與溶劑對照組相比，供試品組大鼠大體解剖和臟體比結果未見明顯差異(P>0.05),主要指標見表17～18。

表17 甘藍強骨片對大鼠臟體比的影響(♂,

表18 甘藍強骨片對大鼠臟體比的影響(♀,

4.2.3.2 組織病理學檢查 各主要臟器大體檢查未發現明顯病變，因此選擇高劑量組和溶劑對照組作組織病理學檢查。高劑量給藥組雌雄鼠各有2只肝臟小葉出現輕度的空泡變、顆粒變和肝細胞腫脹，溶劑對照組有2只雌鼠、3只雄鼠肝臟小葉細胞出現輕度的空泡變、顆粒變和肝細胞腫脹；高劑量組和溶劑對照組各有1只雌鼠、2只雄鼠肝臟匯管區出現輕度的炎癥細胞浸潤，各有1只雌鼠腎臟皮質部腎小管有輕度腫脹，各有1只雄鼠脾臟有輕度的色素沉著；溶劑對照組有1只雌鼠卵巢有輕度囊腫。以上組織病變均屬于動物自發病變，高劑量組雌、雄鼠其他臟器均未見明顯的與供試品毒性有關的病理病變，結果見圖1所示。

圖1 高劑量甘藍強骨片大鼠肝(A)、脾(B)、胃(C)、腎(D)、十二指腸(E)、結腸(F)、卵巢(G)和睪丸(H)組織切片

5 結論與討論

甘藍強骨片由藍刺頭、甘草、桑白皮三位味道地蒙藥材組成。其中，藍刺頭是甘藍強骨片中針對主病證起主要治療作用的一味藥材，具有抑制骨吸收，促進骨形成，對骨吸收和骨形成偶連有一定的調節作用，降低骨轉化率從而可以達到防止骨質疏松[7]。有研究表明[8]，藍刺頭多糖提取物無毒副作用，此外未見其他藍刺頭藥材毒性研究報道。甘草味甘、性平，是能夠調和諸藥的一味藥材，與烈性藥物配伍可緩和藥性功效[9-10]。桑白皮藥材來源于桑科植物桑的干燥根皮，具有良好的抗骨質疏松的作用[11]，早期有研究表明桑白皮藥材無毒性作用[12-13]。

本實驗通過對昆明種小鼠灌胃給予甘藍強骨片顆粒，按0.4 mL·(10 g)-1灌胃給藥，一日內給藥1次，總給藥量為40 mL·kg-1，飼養觀察2周，小鼠無任何異常及中毒反應，行為、活動、進食一切正常，體重增加，說明甘藍強骨片在低于33.86 g·(kg·d)-1劑量條件下無急性毒性作用。通過對Wistar種大鼠灌胃給予甘藍強骨片顆粒，在試驗劑量22.50、11.25和0.45 g·(kg·d)-1對實驗大鼠的生長發育、血液學、血液生化學及病理學方面各項相關指標的檢驗均未發現明顯不良影響，說明甘藍強骨片口服給藥為無毒或低毒。

實驗同期課題組開展了甘藍強骨片的藥效學研究，研究結果表明甘藍強骨片對骨質疏松有一定的治療效果。甘藍強骨片作為治療骨質疏松的一種全新中藥產品，對于骨質疏松患者的用藥提供了新的選擇。本實驗研究結果表明甘藍強骨片給藥為無毒或低毒為其安全性評價奠定了基礎，同時為后續的臨床用藥試驗提供了理論支撐。