阿膠糕中驢皮源成分的質量控制研究

趙艷霞，姜樹銀，鞏麗萍，石峰*，程春雷，羅學剛

(1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

阿膠糕屬于藥食同源產品，采用阿膠配以黑芝麻、核桃仁、冰糖、黃酒等制作出而成，具有補血養氣、美容養顏、潤腸通便、提高免疫力的綜合保健功效，是老少皆宜的具有復合保健價值的產品。阿膠[1]作為主要原材料起主要作用，具有生血作用，可用于失血貧血、缺鐵貧血，并對兒童、青少年的生長發育具有改善作用，因此阿膠的品質也決定了阿膠糕產品的品質。

阿膠糕作為阿膠的衍生品，極具山東地方特色，目前山東省獲得生產許可的企業有129家，占全國90%以上，市場占有量大，主要分布在聊城、濟南等地市。但是近年來的產品檢查中發現市場上存在大量的以次充好，以假亂真的現象，產品質量參差不齊，給地方特色產品帶來了不良影響。因此亟需制定檢測標準，控制產品質量，打擊摻偽摻假現象。

目前對于阿膠糕的皮源成分控制尚未有國家標準、地方標準發布，現有檢測方法多為脂肪、氨基酸等的測定，在查閱文獻及本實驗室阿膠相關研究[2-8]的基礎上，建立了阿膠糕中驢皮源成分的檢測方法，方法簡便、快速、準確、可有效控制產品質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AB SCIEX 5500超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀； XSE205電子天平；高速萬能粉碎機；恒溫數控超聲儀；Vortex-6渦旋振蕩器；Millipore超純水機。

1.2 試劑試藥 乙腈、甲酸為色譜純；丙酮、三氯乙酸、碳酸氫銨及胰蛋白酶均為分析純，水為去離子水。對照品：驢源多肽A2(C51H82N18O18)，含量≥94.2%，購于中國食品藥品檢定研究院；驢源多肽A2同位素內標(C51H82N16O18-15N2)，含量：94.6%，由上海強耀生物有限公司合成。阿膠糕樣品來源于市場及不同廠家共21批次。

2 試驗方法

2.1 色譜、質譜條件 液相條件：色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.5 μm)，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～1.5 min，5%B；1.5～6 min，5%B→50%B；6～6.1 min，50%B→70%B；6.1～8 min，70%B；8～8.1 min，70%B→5%B；8.1～12 min，5%B。流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

液相色譜條件：色譜柱為Waters XBridge BEH C18(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)。流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，10%B；1～5 min，10%B→50%B；5～5.1 min，50%B→70%B；5.1～7 min，70%B；7～7.1 min，70%B→10%B；7.1～10 min，10%B。流速為0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式，多反應監測；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：5 500；氣簾氣：35；霧化氣：50；輔助加熱氣：55；定性、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 化合物的質譜采集離子信息

2.2 溶液配制

2.2.1 驢源多肽A2標準儲備液、內標儲備液 分別取驢源多肽A2標準品、驢源多肽A2同位素內標約10 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶，用1%碳酸氫銨溶液溶解并定容至刻度，搖勻。

2.2.2 標準工作溶液 精密量取驢源多肽A2標準儲備液200 μL于10 mL容量瓶，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，臨用現配。

2.2.3 內標工作溶液 精密量取驢源多肽A2同位素標準儲備液100 μL于10 mL容量瓶，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，臨用現配。

2.2.4 標準曲線制備 精密量取標準工作溶液適量，分別加入一定量內標工作溶液，用1%碳酸氫銨溶液稀釋，配制成濃度為20、50、100、250、500 ng·mL-1的系列標準溶液(內標濃度為200 ng·mL-1)，供液相色譜-串聯質譜測定。

2.3 樣品前處理 取樣品約50 g，冷凍放置過夜，取出，置于粉碎機中粉碎。稱取粉碎好的樣品1.0 g，置于50 mL塑料離心管中，精密加入1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，于4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾，精密量取上清液1 mL，于15 mL塑料離心管中，加胰蛋白酶溶液(1 mg·mL-1)1.0 mL，再加入內標工作溶液100 μL，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至5 mL，搖勻，置于恒溫箱中，于37 ℃恒溫酶解16 h，取出，冷卻至室溫，供液相色譜-串聯質譜測定。

3 結果與討論

3.1 定性測定 在同樣測試條件下，樣品溶液中驢源多肽A2的保留時間與標準工作液中驢源多肽A2的保留時間之比，偏差在±5%以內，且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度相當的標準溶液相對豐度一致。

3.2 驢皮源成分指標的選擇 目前《中國藥典》收載的用于阿膠鑒別的驢皮源成分為驢源多肽A1和驢源多肽A2，在研究中發現，這兩個特征性多肽在阿膠中檢出穩定，但是在阿膠糕的檢測中發現驢源多肽A1結果不穩定，不適合作為指標性成分，因此只選擇了檢出穩定的驢源多肽A2作為阿膠糕中驢皮源成分的檢測指標，適用性更好。

3.3 色譜條件的考察 本研究比較了不同色譜柱及0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液兩種流動相體系對目標化合物進行分離的情況。結果表明不同色譜柱上驢源多肽A2的保留差異不大，樣品溶液經酶解后有一定的基質，填料粒徑越小的色譜柱壓力越大，推薦使用填料粒徑相對大的色譜柱為分析色譜柱。流動相中酸的加入可使氫離子的濃度在梯度洗脫過程中保持穩定，選擇0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作為最終的流動相。驢源多肽A2及其同位素內標溶液(50 mg·L-1)的MRM色譜圖見圖1。

圖1 驢源多肽A2及其同位素內標溶液的MRM色譜圖

3.4 質譜參數的優化 將驢源多肽A2標準溶液(1 μg·mL-1)通過蠕動泵進樣，通過一級全掃描找到驢源多肽A1、驢源多肽A2的母離子，再分別以一級母離子通過二級全掃描找到二級碎片離子，并通過不斷改變碰撞能使碎片離子響應增強，通過優化獲得最佳離子源參數，確定碎裂電壓及碰撞能量。

3.5 酶解條件的優化 結合前期的研究[3-5]，樣品水解采用胰蛋白酶，酶解溫度37 ℃，酶解時間16 h。本研究主要對酶的用量進行了考察，取同一濃度樣品，分別加入不同量的胰蛋白酶，酶解后進樣分析，結果見圖2。

圖2 樣品在不同酶用量下的結果

由圖2可以看出，酶的用量超過1.0 mL以后，結果趨于穩定，樣品完全酶解，綜合考慮，本方法選擇酶的用量為1.0 mL。

3.6 樣品前處理的考察 取樣品樣品濾液分別進行以下兩種處理方式。

3.6.1 樣品濾液直接酶解處理 精密量取樣品濾液1.00 mL，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至5 mL，搖勻，置于恒溫箱中，于37 ℃恒溫酶解16 h，取出，冷卻至室溫，經0.22 μm濾膜過濾，進樣測定。

3.6.2 樣品濾液經30%三氯乙酸沉淀蛋白 精密量取樣品濾液4.0 mL，加入4 mL的30%三氯乙酸溶液，充分振蕩混勻，4 ℃靜置20 min，于8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用2 mL冷丙酮洗滌沉淀，于8 000 r·min-1離心5 min，棄丙酮清液；重復洗滌一次，得沉淀，室溫下置通風櫥10 min揮干丙酮，制得阿膠蛋白提取物。向阿膠蛋白提取物中加1%碳酸氫銨溶液10 mL，超聲使溶解，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至15 mL。再精密量取1.00 mL，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，用1%碳酸氫銨溶液稀釋至5 mL，搖勻，置于恒溫箱中，于37 ℃恒溫酶解16 h，取出，冷卻至室溫，經0.22 μm濾膜過濾，進樣測定。

按照上述兩種樣品前處理方法考察了不同廠家的樣品，同時阿膠對照藥材也按照同法處理，結果見表2。

表2 樣品經不同前處理方法的測定結果

由表2可以看出，樣品直接溶解稀釋后酶解測定方法更簡便、準確度更高，所以樣品制備采用直接溶解稀釋法處理。

3.7 定量方式的確定與基質效應評價 采用液質聯用法進行基質復雜樣品分析，其復雜基質可能會對測定結果產生影響，因此，在方法建立時需對基質效應進行評價[9]。在實驗中對樣品進行不同倍數的稀釋后進樣測定，結果發現隨著稀釋倍數增大，樣品測定結果也增高，說明存在較強的基質效應。本方法測定的目標物為驢源性多肽A2，由于無法獲得空白基質樣品，因此采用同位素內標法消除基質效應。采用內標法測定不同稀釋倍數的樣品，結果穩定。同位素內標法確保了定量結果的準確性。

3.8 標準曲線、線性范圍及定量限 分別將20、50、100、250、500 ng·mL-1的標準曲線工作溶液各2 μL注入液質聯用儀中，以測得的峰面積比值Y為縱坐標，以驢源多肽A2的含量(ng·mL-1)X為橫坐標制作標準曲線，得到線性回歸方程Y=1.321 046X+0.040 333，相關系數r為0.999 6，在20～500 ng·mL-1濃度范圍內，線性關系良好。

將標準溶液逐級稀釋，以3倍信噪比的峰高對應的濃度定為方法檢出限，為0.2 ng·mL-1，折合到阿膠糕樣品中含量為0.05 mg·kg-1；以10倍信噪比的峰高對應的濃度為定量限，為0.6 ng·mL-1，折合到阿膠糕樣品含量為0.15 mg·kg-1。

3.9 精密度 取樣品按照按“2.3”項下樣品前處理進行處理，進樣測定，平行測定6次，考察方法精密度，測定結果的RSD為1.9%，方法重現性較好。

3.10 穩定性研究 分別考察了室溫放置時間為0、1、3、5、7、14、20、24 h的標準溶液(1 000 ng·mL-1)及阿膠經酶解后樣品溶液目標肽段的峰面積變化情況，在被考察的24 h內，驢源多肽A2在樣品溶液和標準溶液中峰面積的RSD值分別為2.5%、3.1%，穩定性良好。

3.11 回收率 本方法通過向樣品(含量為0.099 19 mg·g-1)，并通過向其添加低、中、高 3 個濃度水平的驢源多肽A2標準溶液，每個水平平行測定3次，計算方法回收率，結果見表3。

表3 3個水平下的加標回收率(n=9)

3.12 樣品測定 采用本方法對不同生產企業以及市售阿膠糕樣品進行測定，得到不同廠家不同工藝共21批次阿膠中驢源多肽A2的含量。不同廠家因生產工藝、原料等不同，所測得的驢源多肽A2的含量差異較大，含量為4.5%～21.7%。測定結果說明不同廠家產品質量差異較大，急需對產品進行質量控制。

表4 樣品測定結果

4 結論

本研究建立了阿膠糕中驢皮源成分的檢測方法，方法以特征肽為檢測指標，采用超高效液相色譜-串聯質譜測定，考察了樣品前處理、酶解條件、色譜條件、基質效應，采用同位素內標法定量，方法準確度高。樣品測定結果表明不同生產企業的產品驢皮源成分含量差異較大，說明產品質量參差不齊，提示部分生產企業需改進工藝提升產品品質，同時應注重阿膠原料的質量。本方法操作簡便，結果可靠，重現性好，可用于阿膠糕中驢皮源成分的質量控制。