酒制補骨脂炮制工藝優(yōu)化

陳李東,張學順,劉曉倩

(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

補骨脂別名破故紙，是豆科草本植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實，性溫、味辛，歸腎、脾經(jīng)。具有補腎固精、縮尿止帶、溫脾止瀉、固沖安胎之功效[1-2]。臨床上有廣泛應用，內(nèi)服主治腎虛冷瀉、陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛等；外用主治皮膚病、白癜風[3-4]等。近年來國內(nèi)外研究表明，補骨脂還具有抗菌、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[5]。

據(jù)《雷公炮炙論》記載補骨脂“性本大燥，毒”[6]，其久服有毒副作用，入藥前需經(jīng)過炮制[7]，以使其毒性明顯降低。補骨脂炮制方法較多，課題組前期的試驗研究選取了具有代表性的15種炮制方法，采用高效液相法確定了酒焙法為補骨脂的最佳炮制方法。酒焙法的炮制工藝條件文獻記載較少，缺乏客觀的量化標準，易造成炮制品的質(zhì)量標準可能存在不規(guī)范性的問題。鑒于此，本試驗以補骨脂中的有效成分(補骨脂素、異補骨脂素[8])和有毒成分(補骨脂酚，具有肝腎毒性且具有較高細胞毒性[9-10])為考察因素，采用正交優(yōu)選試驗[11]來優(yōu)化酒焙法炮制工藝條件，為補骨脂的炮制工藝規(guī)范化提供試驗數(shù)據(jù)。

1 試驗材料

1.1 儀器 安捷倫1260分析型高效液相色譜儀；超聲波提取器(昆山市超聲儀器公司)；AB135-S型電子天平。

1.2 試藥 補骨脂藥材(購于安國市任德興藥材有限公司，批號：1804002)；乙腈為色譜乙腈；甲醇為分析純；水(娃哈哈純凈水)；紹興黃酒(浙江塔牌公司)；補骨脂素對照品(購于上海源葉公司，批號:YJ07315A14)；異補骨脂素對照品(購于上海源葉公司，批號:R01A6F1)；補骨脂酚對照品(購于上海源葉公司，批號:YM0316SB13)。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒制補骨脂的制備 取補骨脂9份，每份100 g，按照正交試驗設計加炮制用黃酒悶潤36 h，隨后置于烘箱中烘制。選擇藥酒比例(A)、烘制時間(B)、和烘制溫度(C)3 個因素，每個因素取3 個水平，采用L9(34)正交表安排試驗(因素水平見表1)。考慮到試驗中可能存在誤差的影響，每次試驗平行3次。

表1 正交因素水平表

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫，程序為：0～8 min，20% A→40% A；8～18 min，40% A→70% A；18～21 min，70% A→85% A；21～30 min，85% A；30～32 min，20% A；流速0.8 mL·min-1；檢測波長250 nm；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取3種對照品0.82、0.78、1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 mL棕色量瓶，制得混合對照品溶液，補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚對照品濃度分別為16.4、15.6、39.2 μg·mL-1。

2.2.3 供試品溶液制備 取樣品，粉碎，過60目篩，精密稱取各粉末1.0 g，置于索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流，提取2 h，冷卻，轉(zhuǎn)移到250 mL量瓶，加甲醇適量稀釋到刻度，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，取濾液，備用。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察 采用“2.2.1”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液2、5、8、12、18、30 μL，注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積，以峰面積值(Y)和進樣量(X)進行線性回歸分析，結(jié)果補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的回歸方程分別是Y=6 569.1X-3.835 7(R2=0.999 9)、Y=7 712X-4.332 4(R2=1)、Y=18 884X+3.205 3(R2=1)，進樣量范圍分別在0.033～0.492 μg、0.031～0.468 μg、0.078～1.176 μg線性關系良好。

2.2.4.2 精密度試驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液5 μL，重復進樣6次，記錄混合對照品中補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚峰面積的精密度RSD分別為0.80%、0.75%、0.31%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，取“2.2.3”項下各供試品溶液5 μL，分別于24 h內(nèi)6次測定含量，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.6%，相對峰面積的RSD均小于2.12%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復性試驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，取“2.2.3”項下供試品溶液平行試驗5次記錄樣品的HPLC色圖譜，共有峰的相對峰面積的RSD均小于1.93%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定含有量已知的藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密加入各對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下進樣測定6次，測得各成分加樣回收率分別在99.34%～102.17%，RSD為0.67%～0.83%，表明該方法穩(wěn)定可行。

2.2.5 樣品測定 取“2.1”項下各炮制品，粉碎，過60目篩，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項下的色譜條件測定，精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀分析測定。

2.3 正交試驗優(yōu)選 采用綜合評分法對指標性成分進行評價，將各指標的最大值作為參照標準，對同一指標中數(shù)據(jù)進行了標準化處理，處理公式：Dab=Xab/(Xb)max×100。其中Xab表示第a次試驗中第b個指標的測定值，Dab表示第b個指標的第a個測定值的標準化數(shù)據(jù)，a的取值范圍為1至9；b的取值范圍為1、2、3，設定評價總分為100分，對各炮制品的補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚依次打分評價。補骨脂素和異補骨脂素的Dab值設定為正值，補骨脂酚Dab值設為負值，綜合評分Y值是三者評分之和。試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗表及綜合評分結(jié)果

表3 方差分析表

由直觀分析可知，各因素對酒焙法炮制工藝的影響順序為A>B>C，方差分析表明因素A、B、C都對綜合評價總分Y值具有顯著性的影響，其中A因素影響最大。最佳炮制工藝條件定為A2B2C3，即每100 g補骨脂藥材，加15%的黃酒，烘制溫度140 ℃，烘制時間120 min。

2.4 驗證試驗 精密稱取補骨脂藥材3份，按最佳炮制工藝進行3次重復試驗。結(jié)果測得3份炮制品有效成分含量均高于生品，毒性成分含量均低于生品，平行實驗獲得的樣品的指標性成分含量基本沒有差異，結(jié)果表明優(yōu)選的炮制工藝有很好的重現(xiàn)性，合理可行，測定結(jié)果見表4。

表4 含量測定結(jié)果

3 討論

補骨脂為傳統(tǒng)中藥，臨床應用廣泛。近年來，有關補骨脂臨床不良反應報道越來越多[12-15]，補骨脂的用藥安全問題亟待解決。補骨脂臨床多以炮制品入藥，本課題組前期研究結(jié)果顯示，酒焙法炮制補骨脂優(yōu)勝于其他炮制法。為進一步探討酒焙法的炮制工藝，本試驗通過正交試驗設計，根據(jù)加酒量、烘干溫度和烘干時間炮制出9份不同條件下的補骨脂的樣品。應用高效液相色譜法進行指標性成分含量情況的測定得到酒焙法炮制工藝的影響順序是藥酒比例>烘制時間>烘制溫度。確定了酒制補骨脂的最佳炮制工藝是補骨脂藥材100 g，加15%黃酒，烘制時間120 min，烘制溫度140 ℃。

單因素考察預試驗結(jié)果提示黃酒的用量對補骨脂中指標性成分有一定的影響，開始隨藥酒比例的增加而上升，當藥酒比例達15%時，此時有效成分的含量最高，宋瀟等[16]報道，酒制補骨脂可在炮制過程中發(fā)生補骨脂苷和異補骨脂苷向補骨脂素和異補骨脂素的轉(zhuǎn)化，可能因此引起有效成分的增加。但隨著藥酒比例的增大，二者的含量卻逐漸降低，推測悶潤過程中，大量的黃酒起到了提取溶媒的作用，導致指標性成分溶于黃酒[17]，造成指標性成分含量的損失。補骨脂酚的含量隨酒藥比例的增加而降低，其中藥酒比例從5%到15%時補骨脂酚含量降低的幅度最大。雖然提高酒藥比例，可以降低補骨脂酚的含量，但對有效成分的損失較大。

在烘制過程中，烘制時間的長短和烘制溫度的高低對補骨脂成分的變化也有一定影響。推測烘制激活了藥材中某些酶的活性，在一定烘制時間和溫度范圍內(nèi)，使得補骨脂苷和異補骨脂苷向補骨脂素和異補骨脂素的轉(zhuǎn)化增加，引起有效成分的增加，同時因補骨脂酚具有揮發(fā)性[18]，隨著烘制的溫度升高及時間的延長，該成分含量也隨之下降。

本試驗分別比較了紹興黃酒、即墨黃酒、白酒及95%乙醇4種輔料對補骨脂藥材中指標性成分的影響。通過試驗探究發(fā)現(xiàn)紹興黃酒和即墨黃酒制備的炮制品中補骨脂素和異補骨脂素的含量明顯高于白酒和乙醇，4種炮制輔料對補骨脂酚影響不太明顯，在紹興黃酒炮制品中補骨脂酚成分略低于其他3種炮制品，綜合考慮輔料對補骨脂中有效和有毒成分的影響，因此本試驗采用紹興黃酒作為本試驗炮制輔料用酒。

今后，本試驗將考察補骨脂生品及不同炮制品對氫化可的松造腎陽虛小鼠的治療作用，用于明確藥材炮制前后的藥效學變化，為其量效關系研究奠定基礎。