抗環瓜氨酸肽抗體IgG檢測試劑(酶聯免疫吸附試驗)的臨床試驗*

王思英，楊湘越

1.福建醫科大學附屬第一醫院輸血科，福建福州 350005；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院檢驗科，福建福州 350001

類風濕關節炎(RA) 是一組以關節滑膜炎為主要表現的慢性全身性自身免疫性疾病，在任何年齡均可發病，發病率隨著年齡增長呈現遞增趨勢。有研究顯示RA的全球發病率約為1.0%，在我國為0.32%～0.36%，致殘率高達15%[1-2]，RA患者與相同年齡、性別的健康人比較總死亡率增加[3]。國外較多研究證實，通過對RA患者血清抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體的檢測，能夠對RA患者進行早期病情診斷和預測，對治療和預后監測均具有重要意義[4]。絲集蛋白中的稀有氨基酸瓜氨酸是抗CCP抗體主要的抗原表位，通過比較研究發現，用環化的瓜氨酸肽代替線性的瓜氨酸肽作為酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的抗原基質，可將靈敏度從49%提高到68%，抗CCP抗體是RA的一個高度特異的新指標[5-8]。抗CCP抗體的出現獨立于類風濕因子(RF)。彭吉芳[9]的研究表明，RF不僅存在于RA患者中，在其他疾病(如干燥綜合征、麻風、細菌性心內膜炎等)中也被檢出，甚至在健康人中也被檢出。把RF陰性的患者稱為“血清反應陰性的RA”的說法已經過時了，不應再使用。許多研究顯示，20%～57% RF陰性的RA患者血清中存在抗CCP抗體。因此，平行檢測這兩種抗體有利于提高RA患者的血清學檢出率[10-14]。目前批準上市的抗 CCP 抗體檢測試劑很多，并且在臨床得到了廣泛使用，但大部分基層醫院因成本等原因沒有開展抗 CCP 抗體檢測。為推廣國產抗 CCP 抗體IgG檢測試劑(ELISA)的應用，本研究以上海榮盛生物藥業有限公司生產的抗CCP抗體檢測試劑(ELISA，滬食藥監械(準)字2013第2401823號)為對照試劑，以歐蒙(德國)醫學實驗診斷有限公司生產的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，國械注進20162400106)為第三方試劑，對歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，擬注冊)進行臨床驗證，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 標本來自2019年1—9月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院常規檢測的剩余標本，在≤-20 ℃的低溫條件下長期保存，所有標本的相關信息完整，試劑為歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司作為申請人申請的抗CCP抗體IgG檢測試劑(ELISA，擬注冊)。根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，本試驗所評價試劑屬于二類體外診斷試劑，臨床試驗的總血清標本數至少為200例，同源血漿標本100例，分兩家醫院完成，中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院負責其中的116例有效血清標本及53例有效同源血漿標本。標本分為疾病組(來自臨床懷疑為抗CCP抗體陽性的患者)血清67例、血漿15例，易混組(來自已明確為其他疾病且未送檢抗CCP抗體的患者)血清19例、血漿8例，對照組(健康人群)血清30例、血漿30例。本試驗經中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院倫理委員會批準。

1.2方法 待評價試劑用于體外半定量或定量檢測人血清或血漿中抗CCP IgG型抗體，適應證為RA。本試驗采用對照試驗和雙盲法設計，將同一標本用待評價試劑、對照試劑及第三方分別進行檢測。將待評價試劑檢測結果與對照試劑及第三方試劑檢測結果進行比較，評價待評價試劑與對照試劑及第三方試劑試劑檢測結果的一致性和相關性。采用待評價試劑對同一人的血清和血漿標本分別進行檢測，判斷待評價試劑對血清和血漿標本檢測結果的一致性和相關性。試劑中每個微孔板條含有8個可拆分的包被有合成CCP的微孔。在第1次溫育時，稀釋后的標本(血清或肝素、EDTA、檸檬酸抗凝的血漿)在微孔中反應。如果標本陽性，特異性的IgG(包括IgA和IgM)與抗原結合，為了檢測結合的抗體，加入酶標抗人IgG抗體(酶結合物)進行第2次溫育，以發生顏色反應。

1.3統計學處理 兩種診斷試驗的一致性比較采用定性檢測，以符合率和Kappa值進行評價。Kappa值:≥0.75為一致性好；0.40～<0.75為一致性一般； <0.40為一致性較差。相關性分析采用回歸分析，將待評價試劑檢測結果(Y)分別和對應的對照試劑及第三方試劑檢測結果(X)作回歸分析布圖，建立回歸方程Y=a+bX并分析。R>0.9時,所得到的回歸直線擬合得較好；R<0.5時，所得到的回歸直線很難說明變量之間的依賴關系。

2 結 果

2.1待評價試劑與對照試劑一致性及相關性分析

2.1.1待評價試劑與對照試劑一致性分析 一致性分析結果顯示，陽性符合率為70.00%(21/30×100%)，陰性符合率為95.35%(82/86×100%)，總符合率為88.79%(103/116×100%)，kappa值為0.69。見表1。

表1 待評價試劑與對照試劑一致性分析結果(n)

2.1.2待評價試劑與對照試劑相關性分析 最終共有20份標本的檢測結果在待評價試劑與對照試劑檢測范圍內，對這20份血清標本的結果進行了回歸分析，回歸方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。見圖1。

圖1 待評價試劑與對照試劑相關性回歸分析圖

2.2待評價試劑與第三方試劑一致性及相關性分析

2.2.1待評價試劑與第三方試劑一致性分析 一致性分析結果顯示，陽性符合率為73.53%(25/34×100%)，陰性符合率為100.00%(82/82×100%)，總符合率為92.24%(107/116×100%)，kappa值為0.80。見表2。

表2 待評價試劑與第三方試劑一致性分析結果(n)

2.2.2待評價試劑與第三方試劑相關性分析 最終共有26份標本的檢測結果在待評價試劑與第三方試劑檢測范圍內，對于這26份血清標本的結果進行了回歸分析，回歸方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97。見圖2。

圖2 待評價試劑與第三方試劑回歸分析圖

2.3待評價試劑與對照試劑/第三方試劑檢測結果綜合比較 待評價試劑與對照試劑的檢測結果不符的情況下，采用第三方試劑的結果為準，再次進行了所有結果的綜合，與待評價試劑進行對比，結果顯示，陽性符合率為89.29%(25/28×100%)，陰性符合率為100.00%(88/88×100%)，總符合率為97.41%(113/116×100%)，kappa值為0.93。見表3。

表3 待評價試劑與對照試劑和第三方試劑檢測結果綜合比較(n)

2.4待評價試劑血清與同源血漿標本檢測結果一致性及相關性分析

2.4.1待評價試劑血清與同源血漿標本檢測結果一致性分析 總共53份與血清標本同源的血漿標本采用待評價試劑進行了檢測，一致性分析結果顯示，陽性符合率為81.82%(9/11×100%)，陰性符合率為95.24%(40/42×100%)，總符合率為92.45%(49/53×100%)，Kappa值=0.77。見表4。

表4 待評價試劑血清與同源血漿標本檢測結果比較(n)

2.4.2待評價試劑血清與同源血漿標本檢測結果相關性分析 對同源血清與同源血漿的定量檢測結果進行了分析，最終共有10份標本的檢測結果在待評價試劑與第三方試劑檢測范圍內，對于這10份血清和血漿標本的結果進行了回歸分析，回歸方程：Y= 0.835X+15.886,R=0.92。見圖3。

圖3 待評價試劑血清與同源血漿標本檢測結果回歸分析圖

3 討 論

RA是一類病因未明、以慢性持續性關節破壞為主要臨床表現的系統性自身免疫性疾病，關節受累為其主要而非唯一的臨床表現[15]。近年來有研究發現，抗CCP 抗體陽性的RA 患者更易出現嚴重的關節破壞，且抗CCP 抗體滴度與RA 的病情活動度相關，因而也可作為評判病情及預后的重要指標[16-17]。有研究顯示[18-19]，女性發病率為男性的2～3倍，在GADEHOLT等[20]的研究結果中，抗CCP抗體陽性患者的病程較抗CCP抗體陰性患者長，可能與抗CCP抗體陽性患者的發病更早相關。因此為使疾病能夠得到盡早發現、盡早治療，早期篩查顯得格外重要。抗CCP抗體檢測試劑大量應用于RA患者、健康者，此外，基層醫院的篩查費用較昂貴(尤其使用進口試劑時)，因此推廣國產試劑有利于降低成本費用，這也是本臨床試驗的意義所在。

待評價試劑用于體外半定量或定量檢測人血清或血漿中抗CCP IgG型抗體。本臨床試驗采用了待評價試劑與對照試劑/第三方試劑比較的方法確認了待評價試劑的性能,同時本臨床試驗增加了待評價試劑與第三方試劑的性能對比作為性能評價的補充評價標準。考慮到目前市場上占有率最高的同類產品為歐蒙(德國)醫學實驗診斷有限公司生產的抗CCP抗體IgG測定試劑(ELISA)，有必要將待評價試劑的性能與目前最廣泛使用的產品進行性能比較，因此本臨床試驗選擇歐蒙(德國)醫學實驗診斷有限公司生產的產品作為第三方試劑，并且采用第三方試劑對所有待檢測標本進行檢測。在116例有效檢測血清標本中，待評價試劑與對照試劑間共出現13例不一致結果，經過第三方試劑檢測，待評價試劑與對照試劑/第三方試劑間共出現3例不一致結果。這3例血清標本采用待評價試劑與第三方試劑檢測，結果均在臨界值左右，第三方試劑檢測結果為弱陽性而待評價試劑檢測結果為陰性。因此該3例標本的檢測結果不能說明待評價試劑與第三方試劑檢測性能存在重大差異。

本臨床試驗單位共檢測有效血清標本116例，有效同源血漿標本53例。待評價試劑與對照試劑的血清檢測結果陽性符合率為70.00%，陰性符合率為95.35%，總符合率為88.79%，kappa值為0.69。針對定量結果進行分析，回歸方程：Y=1.629X+0.968 9，R=0.51。表明待評價試劑與對照試劑血清標本檢測結果一致性良好，但是相關性不佳。待評價試劑與第三方試劑的血清檢測結果陽性符合率為73.53%，陰性符合率為100.00%，總符合率為92.24%，kappa值為0.80。針對定量結果進行分析，回歸方程：Y=0.948 5X-4.640 2，R=0.97，表明待評價試劑與對照試劑血清標本檢測結果一致性和相關性良好。待評價試劑與對照試劑檢測不相符的標本，以第三方試劑的而檢測結果為準，最終待評價試劑與對照試劑/第三方試劑的血清檢測陽性符合率為89.29%，陰性符合率為100.00%，總符合率為97.41%，kappa值為0.93。表明待評價試劑與對照試劑/第三方試劑血清檢測結果一致性良好。待評價試劑檢測血清與同源血漿標本陽性符合率為81.82%，陰性符合率為95.24%，總符合率為92.45%，kappa值為0.77。針對定量結果進行分析，回歸方程：Y=0.835X+15.886，R=0.92。表明待評價試劑檢測血清與同源血漿標本的符合性和相關性良好。

綜上所述，本試驗中的待評價試劑與對照試劑/第三方試劑的檢測結果有良好的一致性和相關性，待評價試劑檢測血清與同源血漿標本的一致性及相關性均良好，提示有較好的臨床適用性。