消銀顆粒質量標準研究*

江靜怡，史方超，白玲玲，蘇 華，陸 崟

（中國人民解放軍東部戰區總醫院藥劑科，江蘇 南京 210002）

銀屑病是一種慢性且極易復發的皮膚疾病［1-2］，由免疫、遺傳、感染等多種因素綜合引起，嚴重時會引起代謝性疾病、消化性疾病、心血管疾病、泌尿性疾病等，或使其疾病風險性升高。中醫認為，其由長期邪熱入侵、熱入營血、氣滯、津液不能潤養皮膚所致。消銀顆粒是我院特色制劑［總制字（2016）F501029］，具有行氣活血、清熱解毒功效，用于治療進展期銀屑病［3］，主要成分為荊芥、萆薢、丹參、金銀花、梔子等。現代藥效學研究表明，綠原酸具有抗氧化、抗糖尿病、抗病毒等作用［4-7］，是金銀花、梔子、紅花和當歸的共有成分。但前期研究中檢驗方法較簡單，且方法適應性不好。本研究中建立了主藥荊芥、萆薢、丹參、地黃等的薄層色譜（TLC）法鑒別，以及測定指標性成分總綠原酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），配有VWD 檢測器；UV - 2100 型紫外- 分光光度計（島津儀器上海有限公司）；AE240型電子分析天平（Mettler Toledo精密儀器有限公司，精度為十萬分之一）；FA1204S 型分析天平（上海市精密儀器有限公司，精度為萬分之一）；CF - 6A 型200 克密封式搖擺型粉碎機（浙江省溫嶺市創立藥材器械廠）；薄層層析硅膠G（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

荊芥對照藥材（批號為120911 - 201512），丹參素鈉對照品（批號為110855-201412，純度99.5%），地黃對照藥材（批號為121180-201506），萆薢對照藥材（批號為121545-201002），綠原酸對照品（批號為110753-201716，純度為99.3%），均購于中國食品藥品檢定研究院；消銀顆粒（醫院制劑，批號分別為190523，190608，190716，190815）；金銀花（批號為180906），梔子（批號為180516），均購于南京鶴齡藥業有限公司；紅花（安徽嘉佑中藥飲片廠，批號為18010）；當歸（安徽信和中藥有限公司，批號為170701）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；磷酸（色譜純，上海Aladdin公司）；石油醚、丁酮、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別［8-12］

荊芥：取樣品40 g，研細，加入石油醚（60～90 ℃）100 mL，振搖，放置過夜，濾過，揮干，用石油醚（60～90 ℃）溶解至1 mL，作為供試品溶液。取荊芥對照藥材0.8 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取除荊芥外的其余藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別吸取上述3種溶液，吸取15，2，15μL，點于同一薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8∶2∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃烘約5 min 至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 A。

丹參：取樣品40 g，研細，加100 mL 乙醇，加熱回流2 h，濾過，濾液置蒸發皿中蒸干，加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。取丹參素鈉對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的對照品溶液。取除丹參外的其余藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別吸取上述3 種溶液各3，2，3 μL，點于同一G 薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸（12∶1∶0.8，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液-乙醇（1∶6，V/V）混合溶液，105 ℃烘約5 min 至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 B。

地黃：取樣品40 g，研細，加100 mL 乙醇，加熱回流2 h，濾液置蒸發皿中蒸干，加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。取地黃對照藥材1 g，加乙醇50 mL，加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取除地黃外的其余藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別吸取上述3 種溶液3，5，3μL，點于同一薄層板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（10∶3∶1∶0.3，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛乙醇溶液-3%高氯酸水溶液（1∶1，V/V，臨用現配），105 ℃烘約5 min至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 C。

萆薢：取樣品10 g，研細，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加鹽酸5 mL，加熱回流2 h，冷卻，用石油醚（60～90 ℃）振搖提取3 次，每次30 mL，合并石油醚層，蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取萆薢對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取除萆薢外的其余藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別吸取上述3種溶液20，5，20μL，分別點于同一薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（7∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃烘約5 min 至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 D。

2.2 含量測定［13-16］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸水溶液（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取綠原酸對照品13.20 mg，精密稱定，加入流動相20 mL，制成對照品貯備液；精密吸取5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋成每1 mL 含0.033 mg 的對照品溶液。取樣品1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加25 mL 50%甲醇溶液，稱定質量，30 ℃超聲（功率為200 W，頻率為40 kHz）1 h，冷卻，稱定質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，雙層濾紙濾過，即得供試品溶液。按處方工藝分別制備不含金銀花、梔子、紅花、當歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

1 - 3.供試品溶液（批號分別為190523，190608，190716） 4.對照藥材溶液 5.對照品溶液 6.陰性對照品溶液A.荊芥 B.丹參 C.地黃 D.萆薢圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution（batch No.：190523，190608，190716） 4.Reference medicinal material solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Schizonepetae Herba B.Salvia Miltiorrhizae Radix et Rhizoma C.Rehmammiae Radix D.Dioscoreae Hypoglaucae RhizomaFig.1 TLC chromatograms

1.綠原酸A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性樣品溶液圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖1.Chlorogenic acidA.Reference solution B.Test solution C.Negative sample solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2.2項下3種溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在綠原酸吸收峰處均無峰出現，表明除去4 種藥材后對綠原酸的測定無干擾。色譜圖見圖2。

線性關系考察：分別精密吸取2.2.2項下綠原酸對照品溶液1，3，5，7，9 mL，置10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1 項下色譜條件進樣以對照品質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=27 955X-0.599 3，R2=1.000 0（n=5）。結果表明綠原酸質量濃度在0.003 28～0.029 49 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：吸取2.2.2項下綠原酸對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣5 次，記錄峰面積。結果綠原酸峰面積的RSD為0.13%（n= 5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為190523），按供試品溶液制備方法制備溶液，在常溫下分別于0，1，2，4，8 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.41%（n=5），表明供試品溶液在8 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為190523）5 份，按供試品溶液依法制備，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果綠原酸的平均含量為0.386 mg/ g，RSD為2.15%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為190523）0.5 g，精密稱定，共9 份，分別置錐形瓶中，按低、中、高濃度分別精密加入2.2.2 項下綠原酸對照品溶液4.0，5.5，7.0 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取4 批消銀顆粒，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果4 批 樣 品（批 號分別 為190608，190716，190815，190523）中總綠原酸的含量分別為每袋3.86，3.61，4.19，3.86 mg。

3 討論

3.1 TLC 條件優化

荊芥為方中君藥，具有祛風解毒功效。原質量標準未將其納入，現增加該藥味的TLC 鑒別。丹參中的含量指標性成分較多且復雜，原標準中丹參的TLC 陰性存在干擾［17］，對不同成分進行考察發現，以丹參素鈉為指標性成分，更換展開劑和顯色條件，結果減少了點樣量，且主斑點清晰，重復性好，陰性對照無干擾。原標準中地黃的TLC 對照藥材斑點和供試品主斑點均不清晰，調整展開劑的比例和組成，改變對照藥材的提取方法，結果減少了點樣量，且主斑點清晰完整，陰性對照無干擾。原標準方法顯示萆薢主斑點顏色較淡，分離不清晰，且陰性對照于相應位置產生斑點，更換方法后，主斑點清晰，陰性對照無干擾。

3.2 含量測定指標選擇

考察制劑的指標性成分時，君藥中荊芥揮發油成分胡薄荷酮的含量隨煎煮時間的延長而明顯減少，甚至完全消失［18-20］，即使提取揮發油制粒時噴入，其含量仍有不穩定性，作為質量標準的考察指標較困難，故改為定性鑒別研究。臣藥丹參主要指標性成分為丹參酮類和丹酚酸B，但丹酚酸B 對照品保存條件要求高，需冷凍干燥處理，同時預試驗表明其陰性對照有干擾。丹參主要功效為活血祛瘀、通經止痛，而臣藥金銀花為清熱解毒的良藥，能增強免疫力、消炎解熱，主治熱毒血痢、癰疽疔毒，功效強于丹參。最終采用金銀花中綠原酸為指標性成分，陰性試驗結果表明梔子、紅花和當歸藥材［21-23］中也含有綠原酸，故選擇總綠原酸的含量作為HPLC法的檢驗指標。

3.3 波長選擇

分別將單味藥材金銀花、梔子、紅花和當歸按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并將對照品溶液和對照藥材溶液進行全波長掃描。結果對照藥材溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處出現相應色譜峰，結合全波長掃描圖，發現波形圖均與綠原酸對照品溶液色譜峰吻合，與文獻［14］結果一致。按擬訂色譜條件進樣測定，相應保留時間處的峰均為綠原酸峰，最大吸收波長為327 nm。

3.4 提取溶劑選擇

以甲醇、50%甲醇、流動相分別溶解對照品，以綠原酸峰形為考察指標，發現50%甲醇和流動相溶解的對照峰峰形較好。50%甲醇的提取率高，且操作簡便，故以50%甲醇為提取溶劑。以流動相為溶劑溶解對照品溶劑峰的影響較小，故選擇流動相溶解對照品。

3.5 提取條件選擇

以樣品含量為考察指標，分別進行超聲和加熱回流（30 min和60 min），結果樣品含量在超聲60 min時最高，提取效率最好。考察超聲處理30，60，90 min 時樣品含量變化，超聲60 min 時樣品基本提取完全；考察提取溶劑用量為10，25，50 mL，溶劑用量為25 mL 和50 mL時能提取完全。綜合考慮，最終選擇50%甲醇25 mL，超聲提取60 min。

3.6 色譜條件選擇

參考文獻［24 - 25］，篩選流動相，以峰分離度、峰形、陰性干擾等為考察指標，考察了不同流動相體系（0.4%磷酸水溶液- 甲醇、醋酸- 甲醇、磷酸- 乙腈、醋酸- 乙腈），結果以0.4%磷酸水溶液- 乙腈為流動相時，色譜峰峰形較好；考察了不同比例乙腈- 0.4%磷酸水溶液（13∶87，12∶88，10∶90，V/V），結果乙腈-0.4%磷酸水溶液比例為10∶90（V/V）時，出峰時間、分離度等條件均較好。