腎寶片需氧菌總數(shù)測量不確定度評定

張莉敏，李默耕，王曉梅

（1.山東省棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 棗莊 277000； 2.山東省棗莊市山亭區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東 棗莊 277200； 3.山東省棗莊市市場監(jiān)管綜合服務(wù)中心，山東 棗莊 277000）

需氧菌總數(shù)的測量結(jié)果可反映藥品在生產(chǎn)加工、包裝、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的質(zhì)量控制情況［1］，是評價某產(chǎn)品是否被微生物污染的指標(biāo)。不確定度是指由于存在不可避免的誤差，對被測量值不能肯定的程度。不確定度越小，測量值與被測量的真實值越接近［2］。腎寶片具有調(diào)和陰陽、溫陽補(bǔ)腎、扶正固本功效，本研究中評定了其需氧菌總數(shù)的測量不確定度，以促進(jìn)合理用藥。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：PGL3002 型電子天平（艾德姆衡器＜武漢＞有限公司，精度為0.1 g）；DHP9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；GR60DF 型立式壓力滅菌器（致微＜廈門＞儀器有限公司）；量筒（規(guī)格為100 mL），分度吸量管（規(guī)格為1 mL），均購自天津市天科玻璃儀器制造有限公司。所用儀器及量具均在檢定有效期內(nèi)。

試藥：腎寶片（山東幸福人醫(yī)藥連鎖有限公司，批號為2012604）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為200709），氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號為190728，pH 7.0），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；純化水（山東省棗莊市食品藥品檢驗檢測中心自制）。培養(yǎng)基及純化水經(jīng)適應(yīng)性檢查，腎寶片需氧菌計數(shù)方法經(jīng)微生物檢驗方法學(xué)驗證，均符合要求。

1.2 溶液制備

取樣品10 g，精密稱定，共20 份（編號為1～20），置勻漿罐中，加氯化鈉- 蛋白胨緩沖液100 mL，均質(zhì)溶解，混勻成1∶10（m/V）的供試品溶液，取1 mL 沿管壁緩慢加入含有9 mL氯化鈉-蛋白胨緩沖液的無菌試管中，旋渦混勻，制成1∶100（m/V）的稀釋液。

1.3 計算方法

參照2020 年版《中國藥典（四部）》［3］160-165通則1105 項下方法測量樣品中的需氧菌總數(shù)。取1∶10 和1∶100（m/V）的稀釋液各1 mL，分別加入無菌培養(yǎng)皿中；同時，取1 mL氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入另一無菌培養(yǎng)皿中，作為陰性對照。各培養(yǎng)皿中分別加入20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，瓊脂凝固后，置（33±1）℃條件下培養(yǎng)5 d，計數(shù)。所有步驟均由同一檢測人員操作。

1.4 數(shù)學(xué)模型建立

建立數(shù)學(xué)模型［4］Y=f（X1，X2…Xn） =KX/（mV）。其中，Y為單位質(zhì)量樣品的需氧菌總數(shù)（cfu/g）；K為樣品稀釋后的體積（mL）；X為某稀釋級下n個培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)（cfu）；m為取樣量（g）；V為該稀釋級下取樣體積（mL），一般為1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

依據(jù)本次試驗測定的過程和數(shù)學(xué)模型分析，腎寶片需氧菌總數(shù)的測量不確定度來源主要有樣品重復(fù)性檢測、玻璃量器、加樣體積、天平稱量。

2.2 不確定度分量評定

2.2.1 樣品重復(fù)性檢測

檢測完成后，根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)則，選取平均菌落數(shù)小于300 cfu 的稀釋級為檢測報告的依據(jù)［3］160-165，由于1∶10和1∶100（m/V）的稀釋液均滿足上述要求，故選取含菌落數(shù)最多的、稀釋級為1∶10（m/V）的稀釋液為菌數(shù)結(jié)果報告（見表1）。按1.3 項下方法計數(shù)，得X1和X2。陰性對照皿中菌落數(shù)均為0。

表1 樣品重復(fù)性檢測結(jié)果Tab.1 Results of the repeatability test of samples

依據(jù)殘差平方和公式，利用表中的數(shù)據(jù)，計算20份樣品的殘差平方和依據(jù)貝 塞 爾 公 式 計 算 標(biāo) 準(zhǔn) 差（S） ，S=其中，a為樣品份數(shù)，b為每份樣品的測量次數(shù)，代入數(shù)據(jù)得S=

因每個樣品測量2 次，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度［U（Y）］=相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.2 玻璃量器

20 ℃時，規(guī)格為100 mL 的量筒和規(guī)格為1 mL 的分度吸量管的容量允差分別為±1.0 mL和±0.008 mL［5］，但缺乏置信水平，標(biāo)準(zhǔn)不確定度是假設(shè)校準(zhǔn)引起的，呈矩形分布［6］。計算100 mL 量筒和1 mL 的分度吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為Urel（100 mL）= 0.577 4/ 100 =0.005 8，Urel（1 mL）=0.004 6/1=0.004 6。

2.2.3 天平稱量

電子天平的允許誤差為± 0.1 g［7］。先稱定空盤的質(zhì)量，再稱定空盤和樣品的總質(zhì)量，2 次稱量均獨(dú)立完成，二者為非線性相關(guān)關(guān)系，天平最大允許誤差為矩形分布，故需計算2 次不確定度［8］，標(biāo)準(zhǔn)不確定度（Um）=實際稱取樣品量（m）為10.00 g，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［Urel（m）］=Um/m=0.081 6/10.00=0.008 2。

2.2.4 加樣體積

1∶10（m/V）稀釋過程引入的不確定度與2.2 項下玻璃量器項下的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度相同，Urel（V100mL）=0.005 8，Urel（V1mL）=0.004 6。

2.2.5 合成不確定度

各分量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度互不相關(guān)，故需計算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度［Urel合（Y）］。

計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度［U合（Y）］。U合（Y）=Urel合（Y）×

按照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB/ T 27418A2017）的t分布表［置信概率（P）= 95%，自由度（v）= 20］［2］，可查包含因子（K）為2.09，計算擴(kuò)展不確定度（U），即U合=U合（Y）×K= 0.049 9 × 2.09 =0.104 3。

2.3 不確定度結(jié)果

由表1 可知，腎寶片需氧菌總數(shù)的檢測結(jié)果表示為2.168 3±0.104 3，K為2.09，取反對數(shù)，最終腎寶片需氧菌總數(shù)菌落報告總數(shù)為330～530 cfu/g。

3 討論

分析腎寶片需氧菌總數(shù)測定的不確定度分量發(fā)現(xiàn)，樣品重復(fù)性檢測引入的不確定度分量最大，天平稱量、玻璃量器、加樣體積引入的不確定度分量較小。在樣品重復(fù)性檢測中，檢測數(shù)據(jù)的差異受眾多因素影響，如微生物的活體易變及分布不均勻、生態(tài)環(huán)境多樣復(fù)雜、檢驗方法存在誤差等［3］388，但主要因素為微生物在樣品中分布不均勻，故腎寶片需氧菌總數(shù)測定的不確定度評定主要誤差來源于微生物分布的不均勻。腎寶片需氧菌總數(shù)測量不確定度的評定中，培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗室環(huán)境潔凈度、培養(yǎng)溫度變化等分量引入的不確定度不能直接測量或以統(tǒng)計學(xué)方式進(jìn)行評定［9］，后續(xù)研究將考慮這些因素造成的結(jié)果偏離，以降低由此引入的不確定度，促使需氧菌總數(shù)測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

但由于微生物檢驗的特殊性及難以定量的特性，測量不確定度在該領(lǐng)域的運(yùn)用較緩慢［10］。近年來，食品微生物領(lǐng)域多見測量不確定度評定的文獻(xiàn)報道［11］，藥品微生物相關(guān)文獻(xiàn)報道較少［12］。目前，國家已發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對測量不確定度評定有了明確要求。《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》中規(guī)定，開展檢測的實驗室應(yīng)評定測量不確定度；當(dāng)檢測結(jié)果需要或客戶有要求時，檢測報告應(yīng)帶有與被需求單位要求的測量不確定度［13］。《測量不確定度的要求》（CNAS-CL07）中規(guī)定，檢測實驗室應(yīng)有能力對每項有數(shù)值要求的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評估［14-15］。各級食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)對外出具的檢測數(shù)據(jù)是反映樣品質(zhì)量是否合格的重要依據(jù)，同時反映了實驗室風(fēng)險控制和質(zhì)量控制的情況。故引入測量不確定度對評估定量分析方法的可靠性和測量結(jié)果的準(zhǔn)確性意義較大。