小泛素樣修飾物特異性蛋白酶3通過調節脂滴水平體外促進HepG2細胞丙型肝炎病毒復制

劉文竹，胡 欣，江 偉，左秀靜，朱華軍

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) 是造成慢性肝病的重要病原微生物。HCV感染往往難以引發適當的固有免疫應答，因而導致約80%感染者轉為慢性感染，其中部分患者繼而發展為HCV 感染相關性肝硬化，甚至肝癌[1，2]。小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化修飾是一個高度動態的翻譯后修飾過程，廣泛參與細胞周期調節、基因表達、信號轉導和維持基因組穩定等過程[3]。與此同時，SUMO特異性蛋白酶家族(SUMO-specific protease，SENP)的去SUMO化功能發揮動態調節作用，其中SENP3可通過解偶聯SUMO2和SUMO3，促進癌細胞轉移、細胞增殖或凋亡，并作為感染、缺氧等多種應激的傳感器[4]。近年來，研究顯示脂滴對于HCV的復制具有關鍵性作用，而SENP3是細胞內脂質代謝調節的重要分子，但SENP3在HCV復制過程中扮演的角色尚不明確[5]。本研究初步探究了SENP3對HepG2細胞脂滴水平和HCV復制的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HepG2 細胞和感染性HCV 病毒顆粒( cell-culture-derived infectious HCV，HCVcc) 由安徽醫科大學安徽病原生物學省級實驗室保存。DMEM 基礎細胞培養基、胎牛血清購自美國GIBCO 公司；Lipofectamine? RNAiMAX試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；油紅O、棕櫚酸和油酸購自美國Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒購自Takara公司；實時定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京) 有限公司；抗HCV核心蛋白單克隆抗體、抗SENP3蛋白單克隆抗體和抗GAPDH多克隆抗體購于Cell Signaling公司。HCV RNA、內參GAPDH qRT-PCR引物和SENP3-siRNA 寡核苷酸均由吉瑪基因公司合成。HCV RNA引物序列：5′-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3′，3′- TCGCAACCCAACGCTACTCG-5′；GAPDH引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，3′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-5′；SENP3-siRNA 寡核苷酸序列：5′-GGGCUGGAAAGGUUACUUCdTdT-3′，3′-dTdTCCCGACCUUUCCAAUGAAG-5′。

1.2 HCV感染HepG2細胞 取對數生長期的HepG2細胞，消化后以1×105個/孔的密度接種于24孔細胞培養板，采用添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養基，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養24 h。繼而，按感染復數( multiplicity of infection，MOI)為0.5加入HCVcc，分別于細胞培養箱孵育0 d、3 d和6 d，棄去上清并以預冷的PBS洗滌細胞后采用Western blot 法檢測HCV核心蛋白和SENP3蛋白表達量，每組細胞設3個復孔。

1.3 轉染HepG2細胞 采用脂質體法，取HepG2細胞，以1×105個/孔接種于24孔板，培養過夜。將SENP3-siRNA或NS-siRNA以0.2 pmol/μL(終濃度)溶解于Opti-MEMR溶解液中，另按體積比3：50將LipofectamineRRNAiMAX溶于Opti-MEM?溶解液。將上述溶液等體積輕柔混勻后，室溫孵育5 min，繼而以每孔50 μL混合液加入24孔板，培養3 d。采用Western blot法檢測SENP3蛋白表達水平。另取上述轉染后的HepG2細胞，加入MOI為0.5的HCVcc，感染3 d，采用Western blot法檢測HCV核心蛋白表達量，采用qRT-PCR法檢測HCV RNA水平，采用油紅O染色，觀察細胞脂滴水平[6]。

1.4 細胞蛋白表達量檢測 采用Western blot法，將上述預處理后的細胞棄去培養基，以預冷的PBS洗滌后加入細胞裂解液，充分吹打后將裂解物轉移至EP管中，于冰上振蕩30 min，置于低溫高速離心機，15000 g離心15 min，轉移上清并加入SDS-PAGE上樣緩沖液、煮沸5 min。繼而行SDS-PAGE 電泳，并電轉移至PVDF膜。封閉后，根據蛋白分子量標記剪下目的條帶，以GAPDH作為內參。分別加入兔抗HCV核心蛋白單克隆抗體( 1：1 000)、兔抗人SENP3單克隆抗體( 1：1 000)、抗GAPDH多克隆抗體( 1：2 000)，4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，加入HRP 標記的二抗( 1：5000)，室溫孵育60 min，洗膜后以BCIP /NBT 堿性磷酸脂酶顯色試劑盒顯色，應用Image J 軟件行灰度分析[7]。

1.5 細胞HCV RNA水平檢測 采用qRT-PCR法，取待檢測的細胞，嚴格按照產品說明書采用TRIzol 試劑盒提取總RNA，并采用SYBRGreen 法進行qPCR 擴增反應，以GAPDH 作為內參基因，反應條件為: 95 ℃ 15 s，55℃ 15 s, 68℃ 30 s。循環進行45 次，采用2-ΔΔCt法分析各處理組HCV RNA 水平[8]。

1.6 細胞回補軟脂酸 將棕櫚酸與油酸按1∶2混合，配置含軟脂酸總濃度為0.5 mmol/L的DMEM完全培養基。棄去HepG2細胞原培養基，以上述含脂肪酸培養基于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養12 h[9]。

1.7 細胞脂滴檢測 用PBS洗滌細胞，采用40 g/L多聚甲醛溶液室溫固定10 min，繼而以5 g/L油紅O在避光條件下染色60 min，用PBS洗滌細胞，以100 ng/ml DAPI染色10 min，用PBS洗滌后，在鏡下觀察細胞[9]。

2 結果

2.1 HCV感染HepG2細胞SENP3蛋白表達量上調 在HCV與HepG2細胞共孵育后的第一天、第三天和第六天，檢測顯示以GAPDH作為內參，HCV 核心蛋白相對表達量分別為0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04，SENP3蛋白相對表達量分別為0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04，兩蛋白表達量進行性升高(P<0.05)，提示HCV有效感染HepG2細胞，并且病毒復制增強。與此同時，SENP3蛋白表達量也相應增強，提示在HepG2細胞，HCV感染促進了SENP3表達(圖1)。

圖1 HCV感染HepG2細胞SENP3蛋白表達A：HepG2細胞HCV 核心蛋白和SENP3蛋白表達；B：隨感染時間延長，蛋白表達增強與第一天比， aP<0.01； 與第三天比，bP<0.05

2.2 敲低SENP3蛋白表達抑制HCV 復制 采用脂質體法轉染SENP3-siRNA至HepG2細胞，以非特異性siRNA作為對照，經Western blot法檢測顯示SENP3蛋白表達水平顯著降低，表明該方法可有效下調SENP3表達(圖2A)；繼而，以HCV感染SENP3敲低后的細胞，檢測發現細胞HCV核心蛋白相對水平明顯低于對照組(圖2B)。以轉染非特異性siRNA組細胞為參照，SENP3敲低組細胞HCV RNA水平為54.23±11.35 %，較轉染非特異性siRNA組細胞顯著降低(P<0.01，圖2C)，初步表明SENP3蛋白促進HCV復制。

圖2 敲低SENP3的HepG2細胞HCV復制變化A：轉染SENP3-siRNA后，細胞SENP3蛋白表達水平下調；B：敲低SENP3細胞HCV 核心蛋白表達下調；C：敲低SENP3細胞HCV RNA水平下調與轉染NS-siRNA比，aP<0.01

2.3 敲低SENP3蛋白表達后細胞脂滴水平變化 以油紅O對轉染后的HepG2細胞進行染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察可見轉染非特異性siRNA的HepG2細胞質中散布較多的紅色熒光斑點，而轉染SENP3-siRNA的細胞中熒光斑點顯著減少，見圖3。

圖3 敲低SENP3細胞脂滴變化 轉染SENP3-siRNA細胞紅色熒光斑點數顯著少于轉染NS-siRNA細胞(油紅O/DAPI染色， 400×)

2.4 SENP3下調后回補軟脂酸對HCV復制的影響 以轉染非特異性siRNA組細胞為參照，經qRT-PCR法檢測顯示敲低SENP3的HepG2細胞HCV RNA相對水平為58.2±5.2%，較轉染非特異性siRNA組細胞顯著降低(P<0.01)，而以軟脂酸處理SENP3敲低的HepG2細胞，HCV RNA相對水平為74.6±6.4%，較未經軟脂酸處理組細胞顯著升高(P<0.01，圖4)。

圖4 回補軟脂酸對細胞HCV復制的影響與轉染NS-siRNA比，aP<0.01，與轉染SENP3-siRNA比，bP<0.01

3 討論

脂滴是由單層兩性磷脂包裹疏水核心構成，用于貯存膽固醇酯、三酰甘油等多種中性脂，并可轉化游離脂肪酸以避免抑制脂肪酸積聚及其毒性衍生物的產生[10]。脂滴不僅參與調控脂質代謝、維持細胞內環境穩態，在細菌、病毒、寄生蟲在內的多種病原體感染和免疫過程中亦發揮重要的相互作用[11,12]。HCV可通過“劫持”宿主的脂質進行增殖。HCV利用脂蛋白的組裝和分泌進入內質網，在富含脂質的內質網膜室開始病毒衣殼的形成之前，HCV與脂滴相互作用[13]。以載脂蛋白E (apoE)為代表的交換性載脂蛋白在增強HCV特異性傳染過程中發揮著關鍵作用[14]。與此同時，HCV病毒粒子可能與血管中循環的其他脂蛋白相互作用，并與載脂蛋白和脂質結合[15]。目前認為，在HCV感染的過程中，脂滴參與HCV復制、組裝和病毒顆粒釋放，影響HCV生活周期，并為HCV的能量儲存器和脂質儲庫[16]。在HCV復制時，病毒可利用脂滴相關蛋白47 kD 尾連蛋白(tail-interacting protein 47 kD，TIP47)作為新型輔助因子，通過非結構蛋白5 (nonstructural protein 5，NS5A)蛋白與其相互作用，從而將脂滴膜整合至HCV復制所需膜網結構中[17]。此外，NS5A可與另一種脂滴相關蛋白Rab18結合進而將復制位點募集至脂滴上[18]。近年來的研究顯示，SUMO特異性蛋白酶家族成員SENP3在脂質代謝過程中發揮重要的作用，參與非酒精性脂肪肝等脂質代謝相關疾病的發生和發展。然而，據我們所知，SENP3是否參與HCV感染過程，尚未見報道[19]。

在本研究中，我們發現HCV感染HepG2細胞可上調SENP3蛋白表達水平，而敲低SENP3則降低HCV感染后HCV核心蛋白表達和HCV RNA水平，而HepG2細胞脂滴水平也下降。這些結果初步表明在HCV感染過程中SENP3可促進HCV的復制并調節脂質代謝，提示HCV可能通過影響SENP3表達作為促進其復制的策略之一?；谥慰赊D化游離脂肪酸為中性脂并將其存儲的功能，HepG2細胞與軟脂酸共孵育可提高脂滴水平[20]。在敲低HepG2細胞SENP3蛋白表達水平后，采用軟脂酸回補脂滴水平可有效降低SENP3蛋白表達下調對HCV復制的影響，表明SENP3可能通過調節脂滴代謝而促進細胞HCV復制。有趣的是，有研究顯示在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染HepG2細胞時，SENP3可通過抑制肝細胞AKT磷酸化水平從而抑制HBV DNA載量，且HBV轉基因小鼠肝組織SENP3表達顯著降低[21]。在HepG2-NTCP細胞和人源化小鼠模型，感染HBV的肝細胞SENP3表達水平下降，下調SENP3可減少HBV復制并促進宿主蛋白翻譯，這可能是肝細胞的宿主防御機制之一[22]。上述研究提示SENP3在不同噬肝病毒感染過程中可發揮差異性作用。

綜上所述，本研究初步顯示SENP3可作為新的宿主因子，通過調節脂滴水平促進HCV的復制，并可能為治療HCV感染性疾病提供新的靶點。后續，我們將細化研究涉及該現象的信號通路，以進一步明確其分子調節機制。