三七總皂苷對(duì)非酒精性脂肪性肝病小鼠肝組織脂質(zhì)沉積及NO/iNOS/NF-κB通路的影響*

侯文靖，吳廣明，蓋慧慧

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床常見(jiàn)的肝臟疾病，是指排除酒精及其他明確的導(dǎo)致肝損傷的因素引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多，肝臟脂質(zhì)過(guò)度沉積為典型特性的綜合征，屬于獲得性代謝應(yīng)激肝損傷性疾病[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道稱，全世界約有10億人患有NAFLD，其發(fā)病率高達(dá)25%，且隨著世界范圍內(nèi)肥胖和糖尿病等人口數(shù)量的不斷增加，NAFLD的發(fā)病率和死亡率也逐年上升[2,3]。依據(jù)NAFLD病理學(xué)改變程度的不同，可將其分為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及NASH相關(guān)肝硬化，其中約有20%NASH會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展至肝硬化[4]。NAFLD多由營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、肥胖、高血糖、高脂血癥等因素引起，也可由營(yíng)養(yǎng)不足、短期內(nèi)體質(zhì)量快速下降和中毒等原因造成[5]。從中醫(yī)角度看，NAFLD是由過(guò)食肥甘厚味、感受熱邪、氣滯血瘀等病因造成的肝氣失衡、氣血凝滯、痰瘀互結(jié)。治療NAFLD的關(guān)鍵在于改善痰瘀互結(jié)之證，化痰祛瘀，使肝氣通暢[6]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇和姜黃素等植物及中草藥治療NAFLD效果顯著[7]。三七總皂苷(panax notoginsenosides，PNS)是從中藥三七中提取的活性物質(zhì)和有效成分，具有抗血栓、抗氧化、降血壓、擴(kuò)張血管和活血化瘀的藥理作用[8]。本實(shí)驗(yàn)觀察了PNS對(duì)NAFLD小鼠肝組織脂質(zhì)沉積的影響，并探討了其調(diào)控作用的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物 40只雄性C57BL/6小鼠，4～8周齡，體質(zhì)量為20～25 g，平均為(22.1±2.3) g，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 NAFLD小鼠模型的制備及藥物干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為對(duì)照組、模型組、PNS處理組和辛伐他汀處理組，每組10只。所有小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)，對(duì)照組10只小鼠仍保持正常飲食喂養(yǎng)，給予其他30只小鼠高脂飼料(80%正常飼料、3%膽固醇、7%豬油、10%蛋黃粉)喂養(yǎng)，以構(gòu)建NAFLD小鼠模型。待建模成功后，給予模型組小鼠生理鹽水灌胃，另兩組分別給予PNS(昆藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021369，2.5 g/L)溶液10 mL.kg-1.d-1灌胃或辛伐他汀(廣州南新制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010748，4.2 g/L)溶液10 mL.kg-1.d-1灌胃，各組持續(xù)灌胃處理12 w，期間仍保持高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱質(zhì)量，采取頸椎脫臼法處死小鼠，取血清、稱肝臟、副睪脂肪和腎周脂肪質(zhì)量，按照公式計(jì)算內(nèi)臟脂肪比：內(nèi) 臟 脂 肪 比=副 睪 脂 肪 質(zhì)量(g)+腎 周 脂 肪(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 使用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的BS-280型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等血生化指標(biāo)。

1.4 肝組織一氧化氮(nitric oxide，NO)-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase，iNOS)-核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)，簡(jiǎn)述步驟如下：取小鼠肝組織，研磨、離心后棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解，行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。加5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用Tris-HCl緩沖鹽-吐溫溶液(Tris- buffered saline Tween20，TBST)洗膜3次，每次清洗10 min，分別加入抗NO、抗iNOS、抗NF-κB、抗p-NF-κB和抗β-actin【艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，工作濃度均為1:1000】，在4℃下孵育過(guò)夜。用TBST再次洗膜，用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的抗兔二抗【艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，工作濃度為1:3000】于室溫下再次孵育1 h。用TBST重復(fù)洗膜3次，每次10 min。最后，用Western blot專(zhuān)用試劑(賽默飛世爾科技公司)顯色成像，應(yīng)用Image J分析各蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈放射狀分布，組織排列緊密，無(wú)脂肪空泡或炎癥反應(yīng)；模型組小鼠肝組織顯示肝細(xì)胞腫脹、體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有彌漫性、大小不等的脂肪空泡，甚至伴有空泡融合擠壓細(xì)胞核，部分細(xì)胞呈氣球樣變；PNS處理組和辛伐他汀處理組小鼠肝組織顯示肝細(xì)胞腫脹不明顯，肝臟體積相對(duì)縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的脂肪空泡數(shù)量有所減少，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊、大小均勻。

2.2 各組體質(zhì)量、肝質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪比比較 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，PNS處理組和辛伐他汀處理組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪比顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 各組血脂水平比較 PNS處理組和辛伐他汀處理組血清TC、TG和LDL-C水平顯著低于模型組，而血清HDL-C水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 各組體質(zhì)量、肝質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪比比較

表2 各組血脂水平比較

2.4 各組血清ALT和AST水平比較 PNS處理組和辛伐他汀處理組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.5 各組肝組織NO/iNOS/NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 PNS處理組和辛伐他汀處理組肝組織NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表達(dá)顯著弱于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4、圖1)。

表3 各組血清ALT和AST水平比較

表4 各組肝組織NO/iNOS/NF-κB蛋白表達(dá)比較

圖1 各組肝組織NO/iNOS/NF-κB蛋白表達(dá)水平比較與模型組比，①P<0.05

3 討論

NAFLD是現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)肝病的重要發(fā)病原因之一，并成為未來(lái)幾十年導(dǎo)致終末期肝病的主要因素，在成人和兒童，其發(fā)病率均高居不下[9]。NAFLD主要分為單純性脂肪病變、NASH、肝硬化和肝細(xì)胞癌等[10]。現(xiàn)階段，針對(duì)NASH和NAFLD診斷多采用肝組織活檢，用于明確和診斷疾病分期。雖然此方法準(zhǔn)確性高，但也存在侵入性，檢測(cè)成本高，存在潛在并發(fā)癥和觀察者間個(gè)體差異等缺陷[11]。針對(duì)NAFLD的治療，西醫(yī)主要通過(guò)去除病因進(jìn)行針對(duì)性輔助用藥，給予二甲雙胍或他汀類(lèi)藥物治療，而中醫(yī)則是通過(guò)辨證論治，依據(jù)患者癥狀及體質(zhì)辨證用藥[12]。PNS是從中藥三七的根莖中提取的活性物質(zhì)，具有活血化瘀的功效，研究證實(shí)在多種氣滯血瘀引起的慢性疾病中療效顯著[13]。本研究采用PNS干預(yù)NAFLD小鼠，發(fā)現(xiàn)可顯著改善模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，采用高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建的NAFLD小鼠具有人類(lèi)疾病的特征，對(duì)研究NAFLD的防治有著重要的參考意義[14]。本實(shí)驗(yàn)以高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)動(dòng)物12周，構(gòu)建NAFLD模型小鼠，再給予PNS等干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)PNS干預(yù)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪比顯著低于模型組，血清TC、TG和LDL-C水平顯著低于模型組，而血清HDL-C水平顯著高于模型組。同時(shí)，血清ALT和AST水平也均顯著低于模型組。這些結(jié)果顯示PNS可有效改善NAFLD小鼠肝脂肪變性，減少肝臟脂質(zhì)沉積。PNS減輕肝臟脂質(zhì)沉積的作用可能在于其抗血栓、抗纖維化、抗氧化和活血祛瘀的獨(dú)特藥理作用，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型血液流動(dòng)性減緩，血液逐漸粘稠、凝滯，血脂代謝紊亂[15]。PNS通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速肝組織血液循環(huán)，抑制肝組織脂肪堆積，發(fā)揮良好的降脂效果[16]，從而降低了小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪比，并顯著降低了血清TC、TG、LDL-C、ALT和AST等指標(biāo)水平，提高了血清HDL-C水平，有效改善肝臟脂質(zhì)沉積，與有關(guān)研究結(jié)果[17]相近。

NAFLD屬于慢性炎癥性疾病的一種。NO是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞間信息交換參與介導(dǎo)炎癥性疾病的重要信息載體。iNOS作為NO合成的限速酶，共同參與誘導(dǎo)包括NAFLD和肝纖維化在內(nèi)的疾病進(jìn)展[18]，而NF-κB 則是公認(rèn)的促炎、促腫瘤基因，在多種炎癥性疾病發(fā)病過(guò)程中高表達(dá)[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAFLD小鼠肝組織NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表達(dá)顯著強(qiáng)于正常小鼠，證實(shí)該通路在NAFLD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮促炎和促疾病進(jìn)展的作用[20]。在經(jīng)過(guò)PNS干預(yù)后，小鼠肝組織NO/iNOS/NF-κB通路蛋白表達(dá)被顯著下調(diào)，推測(cè)PNS可能通過(guò)抑制NO/iNOS/NF-κB通路的活化發(fā)揮緩解脂質(zhì)沉積效應(yīng)。PNS的主要組成成分為人參皂苷和三七皂苷，兩者皆有良好的抗炎活性[21]。PNS通過(guò)調(diào)節(jié)NAFLD小鼠免疫反應(yīng)，防止因免疫過(guò)度引起的肝細(xì)胞和組織損傷，進(jìn)而抑制炎癥因子和信號(hào)通路的表達(dá)，最終發(fā)揮顯著的抗炎效應(yīng)[22]，抑制模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，保護(hù)肝功能。

綜上所述，PNS可能通過(guò)抑制NO/iNOS/NF-κB通路蛋白活化，顯著減輕了NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪比，降低血脂水平，改善了脂質(zhì)沉積。