外周血PNPLA3 rs738409基因多態性與非酒精性脂肪性肝病遺傳易感性研究*

李 偉，黃 宇，鐘 璟，韋 雋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見的肝病，在世界范圍內發病率大約為25%[1]。隨著肥胖、2型糖尿病和高血壓等發生率不斷上升，NAFLD患病率亦呈上升趨勢[2]。NAFLD發病機制尚不明確，通常認為是由遺傳因素和環境因素等多種因素共同作用所致[3]。不斷有研究指出，基因多態性與NAFLD遺傳易感性有關[4]。patatin樣磷脂酶結構域蛋白3(patatin like phospholipase domain containing protein 3，PNPLA3)是patatin樣磷脂酶家族成員之一。國外文獻[5,6]報道，PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD患病有關。但國內有關PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD遺傳易感性的報道并不多見。本研究通過分析外周血PNPLA3 rs738409基因多態性探討了其與NAFLD遺傳易感性關系，旨在為發現我國NAFLD患者新的遺傳危險因素，從而為盡早識別易感人群提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年11月～2019年11月我院診治的NAFLD患者162例，男性52例，女性110例；年齡為33～71歲，平均年齡為(52.1±9.1)歲。NAFLD診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南 (2018年版)》的標準[7]，影像學檢查確定存在脂肪肝的表現。排除標準：(1)合并藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、病毒性肝炎；(2)嚴重的器質性疾病；(3)長期飲酒且酒精攝入量為男性>140 g/周，女性>70 g/周。選擇同期體檢的健康人群100例，男性36例，女性64例；年齡為32～72歲，平均年齡為(52.5±9.3)歲。納入健康人群無糖尿病、心臟病、高血壓、肝腎功能異常和不飲酒。兩組研究對象均簽署知情同意書，本研究方案符合《赫爾辛基宣言》及其準則，并通過我院醫學倫理委員會審核。

1.2 臨床資料的收集 收集入選對象性別、年齡、身高、體質量、腰圍和臀圍，計算體質指數(BMI)=體質量(kg)/身高2(m2)，腰臀比=腰圍(cm)/臀圍(cm)。常規檢測血生化指標。

1.3 外周血PNPLA3 rs738409基因測序和分型 采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法檢測外周血PNPLA3 rs738409位點多態性，取外周靜脈血3 mL，立即置入EDTA抗凝管中，采用全血基因組DNA提取試劑盒(購于深圳子科生物科技有限公司)提取基因組DNA。調整DNA濃度為50 ng/ μL，行PCR擴增(試劑盒購于上海百奧生物科技有限公司)，PCR擴增體系為：Taq Buffer 5.0 μL，10mM dNTP 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，ddH2O 10.5 μL，總體積為20 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，72℃終止延伸10 min。對擴增產物進行電泳和純化，將純化產物送至上海生工有限公司測序(美國ABI公司的ABI PRISM3730測序儀)，從而確定該樣本的基因型。PNPLA3 rs738409位點上游引物：5＇-CCTGAAGTCCGAGGGTGT-3＇，下游引物：5＇-CGGGTAGCCTGGAAATAG-3＇，擴增產物為387 bp，引物由上海生工有限公司合成。

2 結果

2.1 一般資料 NAFLD組體質指數、腰臀比以及血清TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、GGT和ALP水平顯著高于對照組(P<0.05，資料未列出)。

2.2 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡情況 PNPLA3 rs738409位點基因型包括GG、GC和CC型三種基因型。經Hardy-Weinberg檢驗，NAFLD組與對照組人群PNPLA3基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性(P>0.05，表1)。

表1 PNPLA3基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(%)分析

2.3 兩組PNPLA3基因rs738409位點多態性分布比較 NAFLD組PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和G等位基因分布頻率顯著高于對照組(P<0.05，表2)。

2.4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指標比較 不同PNPLA3 rs738409基因型的NAFLD患者血清ALT和AST水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT和AST水平顯著高于CC基因型NAFL患者(P<0.05，表3)。

2.5 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相關指標比較 GG和GC基因型NAFLD患者血清TG水平顯著高于CC基因型NAFLD患者(P<0.05)，GG基因型血清TG水平顯著高于GC基因型(P<0.05，表4)。

表2 兩組PNPLA3基因rs738409位點基因型分布(%)比較

表3 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血生化指標比較

表4 不同PNPLA3 rs738409基因型NAFLD患者血脂和相關指標比較

3 討論

NAFLD是一種常見的慢性肝病。在過去幾十年間，我國NAFLD發病率呈現不斷增長的趨勢，且越來越低齡化，可能與我國人口飲食結構、生活方式轉變和物質生活水平提高關系密切[8]。有證據[9]表明，NAFLD與肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征和遺傳多態性密切相關，是由環境因素和遺傳因素共同作用的結果。目前認為，NAFLD發病經典機制為肝臟“二次打擊”學說，基于肝細胞內TG過度沉積的“初次打擊”和由炎癥因子、氧化應激同時參與的進一步加重肝細胞壞死所引起的肝纖維化過程。近年來，全基因組關聯研究分析和候選基因研究從分子水平上加深了對NAFLD發病機制的理解[10]。

PNPLA3位于22q13.31，編碼一個481個氨基酸組成的非分泌性蛋白，具有酰基水解酶活性，屬于非Ca2+依賴的patatin樣磷脂酶家族[11]。PNPLA3在N端具有類似于patatin的結構域，即高度保守序列Gly-X-Ser-X-Gly，對甘油(三酰甘油、二酰基甘油和單酰基甘油)具有水解酶活性，在脂代謝穩態過程中發揮著至關重要的作用[12]。PNPLA3基因在人體肝臟組織表達最豐富，但PNPLA3蛋白的生物學功能尚未完全闡明。國外已開展的研究表明PNPLA3基因rs738409多態性與NAFLD遺傳易感性有關，但其影響NAFLD的具體作用機制有待深入探究。全基因組關聯研究顯示，PNPLA3基因rs738409位點C>G是拉美裔、非裔美國人和歐洲裔美國人NAFLD發生的危險因素[13]。對多個種族人群的進一步研究證實了PNPLA3 rs738409 I148M對NAFLD易感性的影響[14,15]。本研究結果顯示，NAFLD患者PNPLA3基因rs738409位點GG基因型和G等位基因分布頻率顯著高于健康人群，編碼GG基因型和G等位基因攜帶者NAFLD遺傳易感性明顯增加。體外實驗證實PNPLA3蛋白具有水解甘油三脂的生物學功能，但其在體內的生物學活性尚不明確。動物實驗研究[16]表明，PNPLA3對小鼠肝臟甘油三酯水解具有抑制作用。此外，與PNPLA 3(I148M)相關的脂肪變性是由PNPLA3在肝臟脂滴上的積累引起的，PNPLA3在肝臟脂滴上的積聚是肝臟脂肪變性的基礎[17]。故PNPLA3蛋白可能更多參與脂肪合成過程而非脂肪分解過程，而PNPLA3基因rs738409位點C突變為G，導致148位異亮氨酸突變為蛋氨酸，PNPLA3基因rs738409位點多態性改變了PNPLA3蛋白活性中心結構，使得酶活性中心被掩蓋，進而影響脂肪合成和水解過程，最終導致肝臟脂質沉積。研究[18]也表明，PNPLA3基因rs738409位點非同義替換突變(C>G)與肝臟脂肪沉積增加具有相關性，GG基因型人群肝臟脂肪含量顯著升高。文獻研究[19]亦發現，PNPLA3特定位點點突變可顯著影響PNPLA3蛋白功能活性，其中最重要的突變即為PNPLA3 rs738409位點突變，且G等位基因發生肝硬化的幾率是C等位基因的3.9倍，G等位基因與脂肪變性、小葉炎癥、NAFLD活性評分和纖維化也有顯著相關性。本研究結果也發現，GG和GC基因型NAFLD患者血清ALT、AST、TG水平顯著高于CC基因型NAFLD患者，GG基因型高于GC基因型，故攜帶GG和GC基因型NAFLD患者肝功能損傷可能更加嚴重，其TG水平更高，肝臟脂質積累更多。PNPLA3基因rs738409位點等位基因C突變為G，削弱其對脂肪代謝的調節作用，從而導致脂質異位沉積和胰島素抵抗。血清ALT和AST水平上升可能與攜帶GG和GC基因型NAFLD患者肝細胞損傷以及肝臟炎癥活動更加嚴重有關。但三種基因型NAFLD患者血清GGT、ALP、HDL-C、LDL-C、BMI、腰臀比比較，差異無統計學意義，提示PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD疾病嚴重程度的關系可能較復雜，有待進一步研究。一項分析PNPLA3 rs738409多態性與NAFLD易感性的研究[20]發現，PNPLA3 rs738409位點CG/GG基因型增加了巴西受試者NAFLD患病風險，且PNPLA3 rs738409位點GG基因型與非酒精性脂肪性肝炎患者肝酶升高和纖維化有關。總之，G等位基因可能是NAFLD遺傳易感性的重要影響因素，即PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD遺傳易感性存在關聯性。研究報道[21]表明，PNPLA3 I148M變異體與NAFLD發病風險顯著相關，CG基因型增加發病機會2.092倍，GG基因型增加4.566倍。故PNPLA3 rs738409基因多態性可能在NAFLD發病過程中發揮著關鍵作用，但PNPLA3 rs738409基因突變可能并不僅僅是單純的功能喪失，其能否單獨引起脂肪肝還有待深入研究。通過深入研究PNPLA3基因在NAFLD發病過程中的作用機制，為深入闡明NAFLD遺傳易感性及其發病的分子機制提供了新的方向，從而有助于篩選NAFLD高危人群，做到盡早預防、診斷和個體化治療。

綜上所述，PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD遺傳易感性有關。該項研究將有助于指導盡早識別NAFLD易感人群，從而為NAFLD防治提供方向。