miR-204對小鼠心肌缺血再灌注損傷后的作用機制研究

朱為民，沈 秀，徐宇嘯

(浙江省臺州醫院/臺州恩澤醫療中心(集團)恩澤醫院 1.急診科； 2.急診外科；3.病理科，浙江 臺州 318000)

心肌急性缺血發生后，應對組織灌注進行及時恢復治療，但再灌注本身能進一步加劇心肌損傷的受損程度，即引發心肌缺血再灌注(I/R)損傷。相關文獻報道微小RNA(miRNA)作為一類約20個核苷酸的非編碼RNA，其在腫瘤、神經系統、免疫及心血管等疾病中均存在一定的調控作用。既往報道miR-204參與了癌癥、眼科及高血壓等疾病的發生發展，而miR-204對I/R損傷機制的研究在國內尚未報道。通過生物信息學網站預測，2是miR-204其中的一個靶基因，有研究發現2可通過JAK-STAT通路對IGF-1的表達產生抑制作用，進而加劇糖尿病I/R損傷。鑒于此，本研究擬在建立I/R損傷模型基礎上，探討miR-204是否通過抑制SOCS2表達對小鼠I/R損傷作用機制產生影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 50只C57BL/6小鼠購自南京君科生物工程有限公司，每只體質量20～30 g，10～12 周齡。自由進食飲水，適應喂養1 w，飼養環境：清潔級，濕度維持在55%～60%，室溫22℃～25℃，正常晝夜節律。先選用10只小鼠，構建心肌缺血再灌注模型并進行鑒定，之后隨機選擇30只小鼠按鑒定成功的建模方法進行后續實驗。本實驗經本院動物倫理協會批準審核，受到動物倫理協會的監督。

1.2 I/R小鼠模型構建建模前，10只小鼠禁食8 h，采用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠；取仰臥位，消毒后切開小鼠頸前區皮膚，分離組織、肌肉，充分暴露氣管；氣管插管，連接呼吸機；在小鼠第5肋間隙表皮左側做縱向切口，約2 cm，接著逐層對胸大、小肌進行分離，刺穿暴露的第四肋間隙，向左側穿破縱膈，將心臟擠出。在左心耳下緣 0.5 cm處，通過 6-0 縫合線對左冠狀動脈進行結扎。建模成功的判斷標準：當缺血時局部心肌組織蒼白，心電圖監測提示ST段抬高，則表明結扎成功；半小時后，將活結松開且重新計時，若5 min內ST 段恢復或與之前波形存在明顯區別，則再灌注成功。之后將心臟置于胸腔，排氣胸，縫合皮膚。假手術組(Sham，10只)采用同樣的開胸方式，但不結扎左冠狀動脈。

1.3 實驗動物分組與處理 余30只小鼠分為I/R組、mimics-NC組、miR-204 mimics組，每組10只。mimics-NC組、miR-204 mimics組小鼠在建模前48 h將100 uL mimics-NC、miR-204 mimics預先與Lipofectamine 2000混合分別注射至小鼠心肌內。實驗結束后進行后續指標檢測。

1.4 主要試劑 戊巴比妥鈉溶液購自Sigma公司；Lipofectamine 2000及RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；mimics-NC及miR-204 mimics均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，ELISA試劑盒購自貝克曼庫爾特公司；Masson染色試劑盒購自Service Biological Technology公司；PrimeScript RT試劑盒及SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒購自寶生物工程有限公司；ABI PRISM7300系統購自美國ABI 公司；BCA試劑盒購自AmyJet Scientific公司；SOCS2一抗購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自Abcam公司；質粒提取試劑盒購自Promega公司；熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。引物序列：miR-204，上游：5’ GCCAGATCTGGAAGAAGATGTGGTGGGTTAGT 3’，下游：5’ GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA 3’；U6，上游5’CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3’，下游5’ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3’；SOCS2 ，上游：5’ AGCAGTTTGACAGCGTGGTT 3’，下游：5’ CAGGTAAAGGTGAACAGTCCC 3’；β-actin ，上游：5’ CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3’，下游：5’ TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3’。

1.5 實驗室檢測

1.5.1 血清因子 取小鼠腹主動脈血5 mL，3 000 r/min離心，取上清，參照ELISA試劑盒(貝克曼庫爾特公司，加州，美國)說明書操作步驟測定腦鈉肽(BNP)、心肌肌鈣蛋白( CTn-I)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細胞介素-1β( IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)，采用日立全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。對比各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)及炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)水平。

1.5.2 心肌組織形態學觀察 實驗結束后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,立即取出心臟，沖洗殘血至心室腔無血液流出，對去除心室及心房的心臟組織進行沖洗，一部分心肌組織在4%多聚甲醛溶液中固定，一部分組織保存于-80℃。

取置于4%多聚甲醛中固定24 h后的心臟組織，截取心肌組織，做0.3 cm厚的切片，將左室分為6片。常規石蠟包埋切片,做6 μm厚的薄片，置于45℃恒溫箱中烘干。蘇木精染色3 min，于1%的鹽酸乙醇中2 s，1%氨水返藍，伊紅染色3 min，脫水至透明，中性樹脂封片，干燥72 h，于光學顯微鏡下對心肌組織形態學進行觀察。

取置于4%多聚甲醛中的心肌組織，常規切片，脫蠟。在不同酒精梯度中進行浸泡，Masson染色，觀察心肌組織纖維化程度，光鏡下觀察，每張切片選取5個視野進行觀察拍照。

1.5.3 miR-204、2 mRNA測定 通過qRT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中miR-204、2 mRNA的表達，通過RNA提取試劑盒提取心肌組織中總RNA。通過PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄體系10 μL。通過SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒及ABI PRISM7300系統進行熒光定量PCR。反應條件：95℃ 10 min(95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)循環40次。數據予以2法計算目的基因的表達。其中U6是miR-204的擴增內參，β-actin是2 、TNF-a、IL-1β、IL-6的擴增內參。

1.5.4 SOCS2 蛋白測定 采用Western blot實驗測定心肌組織中SOCS2 蛋白表達水平。取心肌組織，經RIPA裂解液裂解，研磨后離心取上清，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。將提取的總蛋白與上樣緩沖液混合，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離蛋白，轉到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，室溫下磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入相應的羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育l h，洗滌，化學發光試劑顯影，蛋白印記圖像用ImageJ2x軟件分析。

1.5.5 熒光素酶活性檢測 采用生物信息學軟件http://starbase.sysu.edu.cn/預測miR-204和2的靶向關系。合成含miR-204結合位點的2 3’UTR啟動子區序列，構建2 3’UTR野生型(WT)質粒(2-WT)。并在該質粒基礎上，突變結合位點，按質粒提取試劑盒方法構建2 3’UTR 突變型(MUT)質粒(2-MUT)。將2-WT、2-MUT質粒分別和mimics NC、miR-204 mimics質粒混勻后共轉染于HEK293細胞。轉染48 h后，使用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2表達情況 各組小鼠的miR-204、SOCS2表達水平比較，差異具有統計學意義(<0.05)，見表1及圖1。所有I/R小鼠的miR-204表達均低于Sham組，而2 mRNA及其蛋白表達高于Sham組，差異有統計學意義(<0.05)。I/R組與mimics-NC組之間miR-204、2表達情況差異無統計學意義(>0.05)，miR-204 mimics組的miR-204表達高于mimics-NC組，2 mRNA及蛋白表達低于mimics-NC組，差異有統計學意義(<0.05)。

圖1 各組心肌組織中SOCS2蛋白的表達Figure 1 SOCS2 protein expression in myocardial tissues of each group

表1 各組小鼠心肌組織中miR-204、SOCS2 表達的比較Table 1 Comparison of miR-204 and SOCS2 expression in myocardial tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠血清中心肌損傷標志物的比較 各組心肌損傷因子(BNP、cTnI、CK-MB及LDH)的表達情況比較，差異具有統計學意義(<0.05)，見表2。所有I/R小鼠的心肌損傷因子表達水平均高于Sham組， mimics-NC組的心肌損傷因子水平均高于miR-204 mimics組，差異均有統計學意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的心肌損傷因子水平比較無顯著性差異(>0.05)。

表2 各組小鼠血清中心肌損傷標志物的比較Table 2 Comparison of myocardial injury markers in serum of each group of

2.3 各組小鼠心肌組織病理學形態的比較 HE染色結果顯示：Sham組心肌組織染色均勻，心肌纖維排列整齊，心肌細胞結構正常，無病理變化；I/R組、mimics-NC組心肌纖維排列紊亂，正常的心肌結構遭到破壞，梗死病灶存在大量炎性細胞的浸潤，心肌細胞較為腫脹，且存在瘢痕組織；miR-204 mimics組心肌纖維結構的受損及炎性細胞的浸潤程度有所減輕，見圖2。

Masson染色結果顯示：Sham組心肌組織纖維排列整齊，著色均勻，未存在膠原成分；I/R組、mimics-NC組藍色區域增多，說明膠原成分增加，心肌纖維化程度明顯，且心肌細胞明顯減少；miR-204 mimics組心肌纖維化程度減輕，見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織鏡下觀(HE×200，Masson×200)Figure 2 Microscopic view of myocardial tissue of mice in each group (HE×200, Masson×200)

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子的比較 各組的炎癥因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)表達水平比較，差異具有統計學意義(<0.05)，見表3。所有I/R小鼠的炎癥因子表達水平高于Sham組，mimics-NC組的炎癥因子表達水平高于miR-204 mimics組，差異均有統計學意義(<0.05)；I/R組與mimics-NC組的炎癥因子水平差異無統計學意義(>0.05)。

表3 各組小鼠血清中炎癥因子的比較Table 3 Comparison of serum inflammatory factors in each group of mice pg/mL)

2.5 miR-204與SOCS2的關系 通過Targetscan預測網站發現miR-204可以結合SOCS2，見圖3a。熒光素酶活性實驗結果顯示：SOCS2-WT和miR-204 mimics共轉染HEK293細胞后，細胞的相對熒光素酶活性降低，差異有統計學意義(<0.05)；而SOCS2-MUT和miR-204 mimics共轉染后，細胞的相對熒光素酶活性無明顯變化(>0.05)，見圖3b。

a. Targetscan網站預測miR-204與SOCS2的靶向關系；b.雙熒光素酶驗證miR-204與SOCS2的靶向關系。圖3 Targetscan網站預測miR-204與SOCS2的靶向關系Figure 3 Prediction of targeting relationship between miR-204 and SOCS2 by Targetscan website

3 討論

miRNA屬于一類長度約為21 nt的RNA，可通過調控靶基因在機體的病理反應過程中發揮重要作用。其中有研究報道miR-204多與癌癥相關疾病的發生發展密切相關，發現miR-204在癌組織中常呈低表達水平，而在癌旁組織中呈高表達水平，對癌細胞的侵襲遷移具有抑制作用，并促進癌細胞的凋亡。還有研究認為miR-204對心血管疾病的發生也具有一定的調控作用，Yu等研究發現沉默lncRNA AK139328可顯著增加miR-204-3p的表達，抑制心肌細胞自噬，對糖尿病型I/R具有緩解作用。

SOCS家族是一類新型的小分子量多肽，近年來研究報道SOCS與心血管疾病發生密切相關。2屬于SOCS家族中的一員，其可作為調控糖尿病I/R損傷的關鍵基因，且可通過 JAK-STAT 通路沉默IGF-1的表達進而加重糖尿病I/R損傷。然而近些年來關于miR-204調控2參與I/R的作用機制研究尚未見報道。鑒于此，本實驗探究了上調miR-204表達水平對小鼠心肌組織中SOCS2的表達情況，結果顯示，miR-204在I/R模型小鼠中呈低表達，在健康小鼠中呈高表達，而2與其表達趨勢恰好相反，且上調I/R小鼠中miR-204的表達可顯著抑制其SOCS2的表達水平。提示miR-204可能通過抑制SOCS2的表達對小鼠I/R的病理機制發揮作用。具體作用原因有待進一步研究。此外，本研究還發現，所有I/R小鼠的BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著高于Sham組；miR-204 mimics組BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平均顯著低于mimics-NC組。這一結果說明上調miR-204的表達可有效降低心肌損傷標志物BNP、cTnI、CK-MB及LDH水平，對I/R小鼠心肌組織損傷的恢復具有促進意義。分析原因可能與上調miR-204表達對SOCS2的表達具有抑制作用有關，因為SOCS2的高表達對I/R病情的加重具有調控作用。

心肌組織病理學異常及心肌纖維化程度加劇均為I/R損傷常見的病理特征，本研究發現，I/R小鼠心肌組織結構遭到嚴重破壞，病灶區出現大量炎性細胞的浸潤，心肌細胞腫大，且心肌纖維化明顯，而miR-204 mimics組小鼠上述病理狀態較陰性對照組明顯減輕。提示上調miR-204的表達對減輕I/R小鼠心肌組織病理損傷及心肌纖維化具有促進意義。研究報道，炎癥反應在I/R發病進展中發揮著重要作用，其中促炎因子，如TNF-a、IL-1β、IL-6，已成為心肌功能異常的關鍵損害因子。促炎因子的釋放將對心肌組織出現大量炎性細胞因子的浸潤具有促進作用，還能造成毛細血管阻塞及細胞毒性物質的合成，最終引發急性組織損傷。本研究結果顯示，I/R小鼠的TNF-a、IL-1β、IL-6水平均顯著高于Sham組；I/R組與mimics-NC組之間的炎癥因子水平無顯著性差異，miR-204 mimics組炎癥因子水平均顯著低于mimics-NC組。提示，miR-204的高表達可有效降低血清中炎癥因子水平，降低炎性反應。分析原因可能是因為miR-204對2具有負調控作用，而有研究報道2可通過抑制JAK/STAT通路來降低TNF-a、IL-6等炎癥因子水平。為了進一步證實miR-204與2之間的作用關系，本研究通過生物信息網站預測二者之間存在結合位點，且采用雙熒光素酶報告實驗證明了2是miR-204的靶基因。進一步說明，miR-204對I/R病理機制的調控是通過靶向抑制2表達來發揮作用的。

綜上所述，上調miR-204的表達，能減輕小鼠I/R病理學狀態，改善心肌損傷指標水平，降低炎癥反應，其作用原因可能與抑制2的表達有關。