超聲波輔助提取金槍魚蒸煮液魚油工藝研究及品質分析

王新宇 王欣欣 位正鵬 陳奕名 王鵬 李銀平 喬樂克 劉瑞志

(1 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003； 2 中國環境科學研究院，北京 100012； 3 青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東青島 266042；4 海洋功能食品國家地方聯合工程實驗室，山東榮成 264309)

舟山漁場位于杭州灣以東、長江口東南的浙江東北部，面積約5.3萬km2，是中國最大的漁場。舟山國家遠洋漁業基地的統計數據顯示，2019年當地金槍魚產量達到6.2萬t，主要加工為生魚片和各類罐藏食品[1]。蒸煮是金槍魚各類罐藏食品加工過程的重要環節。據統計，每加工1.0 t產品，會產生約1.5 t蒸煮液[2]。蒸煮液中含有較高濃度的氮、磷，但由于加工技術限制，這些蒸煮液往往未經處理便排放入海[3]。隨著國家對工業生產環保力度的加大以及舟山漁場振興計劃的實施，研究蒸煮液的處理與再利用顯得尤為重要。

目前對金槍魚加工廢棄物的研究主要集中在對下腳料的再利用方面，如從金槍魚內臟中提取魚油[4-5]、水解金槍魚下腳料(魚頭、魚尾、內臟、魚皮、魚鰭)制備魚蛋白有機液肥原料[6]等，對于蒸煮液的研究報道較少。何鍵東等[7]研究發現，金槍魚蒸煮液中富含油脂，尤其多不飽和脂肪酸含量較高。其中，DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)是ω-3長鏈多不飽和脂肪酸α-亞麻酸的代謝產物[8]，對人體的智力、生長發育和心腦血管都十分有益[9-10]，而且人類無法自身合成DHA和EPA，必須從食物中攝取。此外，含有高油脂的廢水產生的污泥易造成脫水困難，不利于污泥的綜合利用，并會造成下游處置難題。因此，回收蒸煮液中的油脂不僅可以延長金槍魚加工產業鏈，促進加工企業的發展和漁業資源的可持續利用，還可以降低金槍魚加工企業的廢水預處理成本，有利于環境保護。

提取魚油的方法目前主要有復合蛋白酶水解法、傳統淡堿水解法、超臨界流體萃取法、蒸煮法以及有機溶劑法[11]。使用乙醇從草魚內臟和大黃魚魚卵中提取魚油的試驗證實，乙醇作為萃取溶劑具有易回收、無污染、與油脂分離工藝簡單、食品安全風險較低等優點[12-13]。此外，研究表明，超聲波技術可以縮短魚油提取時間，減少溶劑用量，提高提取率，是提取蒸煮液魚油的理想輔助手段[14]。本課題組在前期的研究中發現，向蒸煮液中加入一定體積的無水乙醇后可以實現油脂與蛋白的分離。為了能更高效地采用乙醇萃取法提取蒸煮液中的魚油，本試驗利用超聲輔助乙醇提取金槍魚蒸煮液魚油，通過響應面法優化提取工藝條件，并對魚油進行品質分析(理化指標、脂肪酸組成、抗氧化活性)，以期為金槍魚蒸煮液魚油功能食品的開發和進一步綜合利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

金槍魚蒸煮液來自浙江企潤食品有限公司。14種脂肪酸甲酯混標來自美國Sigma公司。無水乙醇、石油醚、碘化鉀、乙酰丙酮、異丙醇、環己烷、三氯甲烷、重鉻酸鉀、綠原酸、維生素E、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基等試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

AR224CN電子分析天平：奧豪斯儀器(上海)有限公司；超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設備有限公司；精密增力電動攪拌器：常州金壇良友儀器有限公司；TD5A-WS低速離心機：湘儀離心機廠；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；7890A型氣相色譜儀：美國Agilent公司；M7-80EI型質譜儀：北京普析通用儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒸煮液污染物成分測定

采用杜伊等[15]的方法對蒸煮液中的化學需氧量、總氮、總磷、氨氮進行測定。

1.3.2 蒸煮液魚油提取工藝

取適量蒸煮液原料，加入一定體積無水乙醇，然后置于恒溫水浴中，并不斷攪拌。反應結束后離心、過濾、除去殘渣，收集脂類層溶液，即得到粗魚油。采用單因素試驗考察液料比、溫度、時長、超聲功率對魚油提取率的影響，然后用響應面法進行工藝優化。按以下公式計算提取率(%)。

提取率=提取的魚油質量/原料中粗脂肪質量×100

(1)

1.3.3 魚油提取單因素試驗

分別以液料比(1、1.5、2、2.5)、溫度(25、35、45、55 ℃)、提取時長(20、30、40、50、60 min)、功率(48、96、144、192、240 W)為單因素，考察各因素對蒸煮液魚油提取率的影響。

1.3.4 響應面優化設計

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計方法，以超聲溫度、超聲時間、超聲功率為響應變量，并以-1、0、1分別代表變量的水平值，以蒸煮液魚油提取率為響應值，通過響應面分析進行超聲條件的優化。

1.3.5 魚油理化指標測定方法

將提取得到的粗魚油多次水洗，根據相應的國家標準進行理化指標測定。水分及揮發物：《水分及揮發物的測定》(GB 5009.236—2016)；不溶性雜質：《不溶性雜質含量的測定》(GB/T 15688—2008)；酸價：《食品中酸價的測定》(GB 5009.229—2016)；鉛：《食品中鉛的測定》(GB 5009.12—2017)；鉻：《食品中鉻的測定》(GB 5009.123—2014)；鎘：《食品中鎘的測定》(GB 5009.15—2014)；無機砷：《食品中總砷及無機砷的測定》(GB 5009.11—2014)；甲基汞：《食品中總汞及有機汞的測定》(GB 5009.17—2014)；多氯聯苯：《食品中指示性多氯聯苯含量的測定》(GB 5009.190—2014)。

1.3.6 脂肪酸組成分析

試樣前處理：稱取均勻試樣適量，加入2 mL 2%氫氧化鈉-甲醇溶液，在85 ℃水浴鍋中水浴30 min，再加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，85 ℃水浴30 min。水浴后，待溫度降至室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，振蕩萃取2 min后，靜置1 h，等待分層。取上層清液100 μL，用正己烷定容至1 mL。用0.45 μm濾膜過膜后上機測試。

色譜條件：HP-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，載氣流速為0.5 mL/min。進樣量1 μL，分流比10∶1，進樣口溫度250 ℃，FID檢測器溫度250 ℃。升溫程序為：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

1.3.7 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率測定方法方便、快速，被廣泛應用于抗氧化能力評價[16-17]。本試驗參照文獻[18]方法并作適當修改。試驗組取1.0 mL樣品與1.0 mL 200 μmol/L的DPPH-無水乙醇溶液混勻，室溫避光放置30 min。空白組以1.0 mL無水乙醇代替DPPH溶液，其余處理方法相同。對照組以1.0 mL無水乙醇代替樣品，其余處理方法相同。于517 nm波長處測定各組的吸光度。

DPPH自由基清除率(%)=A0-[A0-(Ai0)]/A0×100

(2)

式(2)中，A0為對照組吸光度，Ai為樣品組吸光度，Ai0為空白組吸光度。

1.4 統計與分析

利用Origin 8.5軟件和Design Expert 8數據處理系統進行數據分析，所有數據均為3次重復試驗的平均值。采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，設顯著性水平為0.05。

2 結果

2.1 蒸煮液污染物分析

對蒸煮液樣品進行污染物成分測定，結果見圖1。雖然在蒸煮過程中的用水量僅占整個加工過程的3%左右，但所產生的化學需氧量、總氮、氨氮、總磷占比分別達52%、37%、28%、13%。

圖1 蒸煮液主要污染物含量

2.2 魚油提取單因素試驗

2.2.1 液料比對魚油提取率的影響

當溫度為35 ℃，提取時長為30 min，超聲功率為144 W時，不同液料比對魚油提取率的影響見圖2。當液料比為1.5時，魚油提取率為69.92%，繼續增加液料比對提取率沒有顯著影響。考慮到乙醇用量和蒸餾分離成本，選擇1.5為最佳提取率。

注：數據標注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 溫度對魚油提取率的影響

當液料比為1.5，提取時長為30 min，超聲功率為144 W時，不同提取溫度下魚油的提取率見圖3。當溫度較低時，魚油提取率較低，當溫度升高后，乙醇對油脂的溶解度增大，魚油提取率也隨之上升。在溫度為35 ℃時，魚油提取率為71.55%，但溫度繼續升高，魚油提取率的增幅下降。考慮到工業應用及能耗問題，選取35 ℃為作蒸煮液魚油的提取溫度。

注：數據標注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.3 提取時長對蒸煮液魚油提取率的影響

當液料比為1.5，溫度為35 ℃，超聲功率為144 W時，不同提取時長對魚油提取率的影響見圖4。當提取時長為40 min時，魚油的提取率為77.54%，之后延長提取時間，魚油提取率的變化較小。

注：數據標注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 超聲功率對蒸煮液魚油提取率的影響

當液料比為1.5，溫度為35 ℃，提取時長為40 min時，不同超聲提取功率對魚油提取率的影響見圖5。當提取功率為144 W時，提取率達到81.80%，之后功率繼續增加，提取率增幅降低。

注：數據標注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間無顯著差異(P>0.05)。

2.3 響應面試驗

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗

結合單因素試驗，選擇時間、溫度、超聲功率三因素三水平，進行響應面分析，以確定蒸煮液魚油提取過程中超聲波處理的最佳工藝條件。試驗設計及結果見表1。

表1 響應面方案設計和試驗結果

擬合得魚油提取率(Y)與溫度(A)、時長(B)和超聲功率(C)之間的二次回歸方程模型為：Y=+88.56+3.02A+6.51B+7.07C-5.68AB-3.78AC-2.79BC-12.87A2-2.96B2-11.34C2

方程的決定系數R2=0.921 8，說明該回歸方程的擬合度較好，可通過此方程對試驗結果進行分析。響應面試驗方差分析結果見表2。

表2 回歸分析結果

由表2可見，模型差異極顯著(P<0.01)，失擬項P=0.655 0，差異不顯著，說明該模型擬合度良好，有一定可靠性，證明采用響應面法預測金槍魚蒸煮液魚油的提取率可行。F值與響應值的影響成正比，F值越大，對響應值的影響越大[19-20]。各因素對魚油提取率的影響順序為C(超聲功率)>B(時間)>A(溫度)。其中，模型的極顯著因子項有C、A2和C2(P<0.01)，顯著的因子項為B(P<0.05)。

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用對魚油提取率影響的響應面和等高線圖見圖6。由圖6可見，魚油提取率隨著時長增加而增大，隨著溫度和功率的增大呈現先上升后下降的趨勢。對比圖6-a、c、e，各因素對響應面的陡峭程度影響由大到小依次為：功率>溫度>時長。這與方差分析結果相同。從圖6-b可知，時長與溫度的立體投影-等高線為橢圓形，因素的交互作用影響顯著；溫度與功率的立體投影-等高線為圓形(圖6-d)，交互作用不顯著；功率與時長的立體投影-等高線為橢圓形(圖6-f)，交互作用顯著，均與方差分析結果一致。結果表明，響應面優化設計較好地反映了溫度、時長、功率對魚油提取率的影響。

2.3.3 最佳工藝條件的預測與驗證

由Design Expert 8.0軟件預測得出超聲輔助無水乙醇提取蒸煮液魚油的最優工藝條件為：提取時長60 min，提取溫度34.33 ℃，超聲功率154 W。最優條件下的魚油提取率預測值為92.74 %。考慮到實際操作的可行性，將以上工藝條件修正為：提取時長60 min，提取溫度34 ℃，超聲功率154 W。在修正條件下進行3次平行驗證試驗，得到魚油平均提取率為(91.32±0.34)%，與理論預測值相符，說明該優化結果可靠，具有實際應用價值。

2.4 理化指標鑒定

由表3可知，酸價符合精制魚油二級標準；碘價、過氧化值符合精制魚油一級標準，說明超聲輔助乙醇法提取的魚油具有較好的品質。

表3 魚油理化性質

2.5 污染物含量分析

對本方法制得的魚油進行了相關重金屬含量的檢測，結果發現，鎘的含量要明顯高于鉛、鉻、無機砷、甲基汞，但均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量，同時多氯聯苯含量也遠低于國家的限量標準(見表4)。

表4 魚油中污染物含量 單位：mg/kg

2.6 脂肪酸組成分析

由表5可知，用本方法提取的蒸煮液魚油的脂肪酸組成不僅富含ω-3多不飽和脂肪酸——DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)，同時含有較高的單不飽和脂肪酸(棕櫚油酸和油酸)。

表5 魚油脂肪酸組成

2.7 抗氧化活性分析

本試驗以DPPH自由基清除能力來表征魚油的抗氧化活性。由圖7可見，隨著魚油質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也在增加。當魚油質量濃度為30 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為(92.36±1.55)%。分析結果顯示，魚油對DPPH自由基的半抑制質量濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)為(6.13±0.53)mg/mL。

圖7 金槍魚蒸煮液魚油的DPPH自由基清除率

本文選取維生素E(VE)和酚類抗氧化劑綠原酸，研究其對魚油抗氧化的協同作用。由表6可見，當魚油質量濃度為2 mg/mL時，不同質量濃度的VE、綠原酸與魚油組合對DPPH自由基的清除率有協同作用，其中，2 mg/mL魚油與2 μg/mL VE的組合協同作用最強，協同值為13.51%。VE對魚油抗氧化的協同作用強于綠原酸。當魚油質量濃度為4 mg/mL和6 mg/mL時，魚油與VE或綠原酸組合均對DPPH自由基清除率表現為拮抗作用。

表6 魚油與維生素E、綠原酸的組合對DPPH自由基的清除能力

3 討論

金槍魚經過原料預處理、蒸煮、去骨修整、罐裝、殺菌、冷卻等步驟后，可制成金槍魚罐頭，其中蒸煮是生產加工過程中的主要環節[21]。污染物分析試驗結果顯示，蒸煮液中含有較高的化學需氧量、氨氮、總磷、總氮，因此，對蒸煮液進行處理與再利用不僅能夠有效減少環境污染，還可以提高金槍魚生產加工的附加值，帶來經濟效益。本試驗采用超聲波輔助乙醇法提取魚油，通過響應面法對于提取工藝條件進行優化，結果發現，當液料比為1.5時，蒸煮液中的大部分魚油已被提取，此時魚油與乙醇溶液達到平衡狀態[13]；提取溫度的升高會增加溶劑分子和油脂分子的動能，促進擴散運動的進行，使油脂提取率增加[22]；但當提取達到一定時長后，提取過程變為動態平衡，提取率不再增加[23]；超聲波輔助可以縮短提取時長，提高提取率，因為隨著超聲波功率的增大，油脂易與非脂成分如蛋白質分離而提高提取率[24]，但是當超聲功率過大時，超聲波的傳播衰減將增大，導致提取率增速減慢[25]。本試驗中，響應面優化設計較好地反映了溫度、時長、超聲功率對魚油提取率的影響，在修正條件下的3次平行試驗也進一步驗證了該優化結果的可靠性和可行性。

理化指標鑒定結果顯示，超聲輔助乙醇法提取的魚油具有較好的品質，其酸價、碘價、過氧化值與何鍵東等[7]經脫膠、脫酸、脫色及脫臭所得的結果相近。其中酸價、過氧化值與郭休玉等[12]等采用乙醇提取的草魚內臟魚油結果相近，明顯低于王倩倩等[26]等采用酶法制得的羅非魚魚油。

海水污染中的重金屬如鎘、鉻、鉛、砷污染已經成為全世界的問題，這些金屬易在海產品生物體內富集[27]。張乾通[28]研究發現，舟山漁場鉛、鎘、甲基汞的超標率分別為3.90%、11.35%、2.84%。經檢測，本試驗方法制得的魚油，其鉛、鉻、鎘、無機砷、甲基汞、多氯聯苯均在國家限量范圍內。

金槍魚的DHA含量是魚類中最高的[29]。本試驗方法提取的魚油，其DHA質量分數高達36.18%，明顯高于三文魚[24]、虹鱒[25]、羅非魚[26]、魷魚[30]魚油中DHA的質量分數，也高于何鍵東等[7]采用胰蛋白酶酶解金槍魚蒸煮液的方法提取并經過脫膠、脫酸、脫色、脫臭制得的精制魚油。這說明超聲輔助乙醇法提取的魚油有利于開發功能性魚油產品。目前關于金槍魚魚油抗氧化活性的報道還很少，本文從蒸煮液中提取出的魚油具有較好的抗氧化活性，其IC50值與鮐魚魚頭油(5.95 mg/mL)接近[31]。

目前協同作用已成為抗氧化劑領域中的研究熱點[32]，金槍魚蒸煮液魚油的協同抗氧化效果和藍圓鲹抗氧化肽與其他抗氧化劑[33]以及蝦青素與β-胡蘿卜素[34]相似。這可能是因為魚油中多不飽和脂肪酸含量較高，當與其他抗氧化劑混合時，隨著濃度的增大，一些未知的潛在的相互作用被放大而導致復合抗氧化能力降低，表現出負協同作用[35]。

4 結論

本研究對超聲輔助乙醇提取金槍魚蒸煮液魚油工藝進行了優化。研究結果，最優工藝條件為：提取溫度34 ℃，提取時長60 min，超聲功率154 W。在該工藝條件下魚油的提取率為91.32%。該工藝提取的魚油，其酸價、碘價、過氧化值分別為1.86 mg/g、145.8 g/100 g、2.06 mmol/kg，可達到精制魚油標準；鉛、鉻、鎘、無機砷、甲基汞、多氯聯苯標的含量分別為<0.02、<0.01、0.07、<0.03、<0.008、<0.000 5 mg/kg，均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量；提取的魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸，DHA和EPA總量達40.49%，其對DPPH自由基的半抑制質量濃度(IC50)為6.13 mg/mL，且低濃度魚油可與VE或綠原酸組合產生協同抗氧化作用，但高濃度魚油與VE或綠原酸的組合對DPPH自由基的清除率均表現為拮抗作用。