CLDN9與胃癌糖酵解水平的相關性及臨床意義

韓延敏，李云榮，周而樂，宋 健，李 紅，曹 璋，吳淑華

胃癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤，近年胃癌的手術治療、化療及靶向治療等均取得較大進展，但是胃癌患者的術后5年生存率仍不理想[1-2]。研究表明，緊密連接蛋白(Claudin)與腫瘤的發生、發展、轉移等密切相關[3]。CLDN9(Claudin-9)作為緊密連接的重要組成部分，其表達異常影響緊密連接的功能。CLDN9在多種腫瘤如肺癌、肝癌中表達異常，可作為評估腫瘤預后的指標之一[4-5]。新近研究表明，CLDN9與子宮內膜癌、食管腺癌的糖酵解水平相關[6-7]。目前，有關CLDN9與胃癌糖酵解水平的研究尚未見報道。本文通過檢測CLDN9與葡萄糖轉運蛋白-1(GLUT-1)及糖酵解關鍵限速酶PKM2、LDHA在胃癌中的表達水平，分析CLDN9、GLUT-1、PKM2、LDHA與胃癌臨床病理特征及預后的關系，著重探討CLDN9和胃癌糖酵解水平的相關性，為胃癌的浸潤轉移機制及預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 從TCGA基因庫中篩選343例胃癌和30例正常胃黏膜組織中mRNA的表達數據及臨床資料。收集2014年1月～2016年3月濱州醫學院附屬醫院病理科存檔的胃腺癌標本91例及相應癌旁正常胃黏膜組織，根據WHO(2019)消化系統腫瘤分類標準進行分類。所有患者術前均未經放、化療及生物學治療。其中，男性58例，女性33例，年齡44～83歲，中位年齡64歲；腫瘤直徑1.2～11 cm，平均5.0 cm；分化程度：高分化17例，中分化34例，低分化40例；浸潤深度：黏膜層或黏膜下層合計19例，肌層9例，漿膜下層及漿膜層63例；有淋巴結轉移者61例，無淋巴結轉移者30例。隨訪截至2021年3月或患者死亡。

1.1.2試劑 兔抗人CLDN9多克隆抗體購自Proteintech公司。兔抗人LDHA、PKM2多克隆抗體購自Abcam公司。兔抗人GLUT-1多克隆抗體和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學數據分析 登錄TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)，獲取343例胃腺癌和30例正常胃黏膜組織中mRNA表達數據，并下載患者臨床數據。使用R-studio軟件中的“edgeR”和“limma”對TCGA數據庫來源的mRNA表達數據進行預處理，對CLDN9在胃腺癌及正常胃黏膜上皮組織中的表達進行比較。將從TCGA數據庫下載的同一患者ID的mRNA基因數據與臨床數據進行合并，以CLDN9基因表達的中位數為界，將胃癌患者分為高表達組與低表達組，使用R-studio軟件中的“survival”和“survminer”制作Kaplan-Meier生存分析曲線，觀察目的基因高、低表達差異對患者生存期的影響。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化EnVision法染色，常規石蠟組織切片經二甲苯脫蠟至水，EDTA修復抗原，3% H2O2孵育去除內源性過氧化物酶，加入山羊血清封閉，滴加一抗CLDN9(1 ∶100)、PKM2(1 ∶100)、LDHA(1 ∶150)、GLUT-1，置于4 ℃過夜孵育。PBS洗滌2次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后，DAB顯色，蘇木精復染，分化，脫水透明，中性樹膠封固。

1.3 結果判定CLDN9、LDHA主要表達于細胞質，以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性；GLUT-1主要表達于細胞膜，以出現棕黃色顆粒為陽性；PKM2陽性為細胞質和細胞核中出現彌漫棕黃色顆粒。免疫組化結果判定采用半定量積分法，根據陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比評分。(1)根據陽性細胞染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據陽性細胞百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分結果相乘作為最終結果：≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.4 統計學分析采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism軟件進行統計學分析，計數資料用率表示，資料分組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearson關聯性分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，采用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析CLDN9 mRNA在胃癌中的表達及預后從TCGA數據庫獲取的25例配對胃腺癌組織中有18例CLDN9 mRNA的表達量明顯高于正常胃黏膜上皮組織(圖1)，差異有統計學意義(P=0.001 8)。根據CLDN9 mRNA表達的中位數(5.315)將343例胃癌患者分為低表達組和高表達組，Kaplan-Meier生存分析顯示，CLDN9低表達組中位生存時間為1 294天，預后明顯優于高表達組(649天，P=0.048，圖2)。

圖1 胃癌及配對正常胃黏膜組織中CLDN9 mRNA的表達量

圖2 TCGA數據庫中CLDN9 mRNA表達量對胃癌患者總生存期的影響

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA的表達免疫組化結果顯示，CLDN9主要表達于細胞質(圖3)，GLUT-1主要表達于細胞膜(圖4)，PKM2主要表達于細胞質和細胞核(圖5)，LDHA主要表達于細胞質(圖6)，四者在癌旁正常胃黏膜組織的陽性率分別為8.2%(7/85)、1.1%(1/85)、16.4%(14/85)、14.1%(12/85)，在胃癌組織中的陽性率分別為65.9%(60/91)、61.5%(56/91)、86.8%(79/91)、78.0%(71/91)，均高于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.001，圖7)。

圖3 A.正常胃黏膜組織中CLDN9呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中CLDN9呈陽性，EnVision法 圖4 A.正常胃黏膜組織中GLUT-1呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中GLUT-1呈陽性，EnVision法 圖5 A.正常胃黏膜組織中PKM2呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中PKM2呈陽性，EnVision法 圖6 A.正常胃黏膜組織中LDHA呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中LDHA呈陽性，EnVision法

圖7 胃腺癌及正常胃黏膜組織中CLDN9、GLUT-1、PKM2與LDHA的表達

2.3 胃癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表達與臨床病理特征的關系胃腺癌組織中CLDN9、GLUT-1表達與患者中位年齡、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移有關，差異有統計學意義(P<0.05)；PKM2表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移有關，差異有統計學意義(P<0.05)；LDHA表達與胃腺癌臨床病理特征均無關(P>0.05，表1)。

表1 胃腺癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表達與臨床病理特征的關系

2.4 胃癌中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA的相關性分析根據免疫組化染色結果將91例胃腺癌分為CLDN9陽性組和陰性組，并分析其與GLUT-1、PKM2、LDHA表達的相關性。結果顯示，CLDN9陽性組中GLUT-1、PKM2、LDHA的陽性率分別為70.0%、93.3%、85.0%，均高于CLDN9陰性組(45.2%、74.2%、64.5%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。Spearman相關性分析顯示，胃腺癌組織中CLDN9表達與GLUT-1、PKM2、LDHA表達均呈正相關(r=0.242，r=0.268，r=0.234)，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 胃腺癌中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA蛋白表達的相關性

2.5 預后91例胃癌患者中位生存時間為54個月，平均5年生存率為39.6%。Kaplan-Meier生存分析顯示，胃腺癌患者預后與CLDN9、PKM2、LDHA、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移相關，CLDN9陽性胃癌患者比CLDN9陰性胃癌患者預后差，差異有統計學意義(P<0.05，圖8)。Cox多因素回歸模型分析顯示，CLDN9、PKM2、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經侵犯均是胃腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05，表3)。

圖8 胃腺癌預后生存分析：A.CLDN9預后生存分析；B.PKM2預后生存分析；C.LDHA預后生存分析；D.腫瘤大小預后生存分析；E.分化程度預后生存分析；F.浸潤深度預后生存分析；G.脈管侵犯預后生存分析；H.神經侵犯預后生存分析；I.淋巴結轉移預后生存分析

表3 胃腺癌患者預后Cox多因素分析

3 討論

Claudin蛋白是細胞間緊密連接的重要組成成分，具有調節上皮細胞和內皮細胞間的防御和屏障功能，維持細胞間黏附、分化和極性，其異常表達能夠導致緊密連接功能失常，影響細胞間的黏附，促進腫瘤的增殖、轉移和復發[8]。Claudins是一個由至少27個成員組成的多基因跨膜蛋白家族，基本結構包括4個跨膜(TM)螺旋結構、2個細胞外環(ECLs)、1個N-末端和1個C-末端[9]。部分Claudin，如CLDN1、CLDN4、CLDN7、CLDN18.2已被證實與胃癌發生、發展相關。CLDN1在胃癌中表達上調，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，與患者預后不良相關，有望成為胃癌早期診斷的生物學標志物[10-11]。與正常胃黏膜組織相比，CLDN4在胃癌組織中表達降低，其表達與胃癌分化程度、侵襲、遷移呈負相關，CLDN4過表達預示患者具有更好的預后[12-13]。Wu等[14]研究發現CLDN7在胃癌組織中的表達明顯升高，且CLDN7過表達可抑制E-cadherin的表達水平，促進胃癌細胞上皮-間質轉化，增強腫瘤侵襲、轉移能力。CLDN11在胃癌中因其啟動子的高甲基化而表達下調，增強胃癌細胞的生長、增殖和遷移[15-16]。在正常組織中CLDN18.2僅在分化型胃黏膜上皮細胞中表達，并在胃黏膜上皮細胞惡性轉化時被激活，在彌漫型胃癌中常高表達。目前，針對CLDN18.2的靶向藥物IMAB362在臨床試驗中已取得較好的療效[17-18]。

CLDN9是一種與細胞通訊連接發育相關的蛋白，在人聽力中起至關重要的作用，其破壞會導致感音性神經聽力損失[19]。CLDN9的破壞不僅影響機體的生理功能，在腫瘤進展期緊密連接功能的破壞會使細胞極性丟失以及細胞間的信號通路發生障礙。CLDN9在垂體瘤中的表達增加，且在侵襲性垂體瘤中CLDN9的表達水平高于非侵襲性垂體瘤，CLDN9的表達量增加與腫瘤侵襲性呈正相關[20]。CLDN9在肝細胞癌中表達上調，通過激活Tyk2/Stat3信號通路促進肝癌的侵襲、轉移[4]。CLDN9過表達還與肺癌的轉移密切相關，敲除CLDN9可顯著抑制肺癌的轉移[5]。Yu等[21]通過數據分析發現CLDN9在胃癌和正常組織中存在差異性表達，且在胃癌組織中表達上調。因此，本實驗采用生物信息學技術和免疫組化分析CLDN9在胃腺癌和癌旁正常黏膜組織中的表達，結果顯示CLDN9在胃腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常黏膜組織，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理特征相關。目前，有關CLDN9與Claudin其它家族成員間的關系，在胃癌進展轉移研究中尚未見報道。

腫瘤細胞通過代謝重編程能在營養匱乏的微環境下存活和增殖，其中糖代謝異常在維持腫瘤的惡性特征中發揮重要作用。腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下仍以糖酵解的方式獲取生長增殖所必需的能量，而不是依賴于氧化磷酸化，腫瘤的這種特殊生物學特征被稱為Warburg效應[22]。腫瘤糖酵解效率主要依賴蛋白質和糖酵解關鍵酶，尤其是GLUT-1、PKM2、LDHA。

GLUT-1與Warburg效應密切相關,是葡萄糖跨膜轉運的重要載體，作為糖酵解的重要調節因子之一，下調GLUT-1會抑制葡萄糖的攝取和乳酸的產生，研究表明GLUT-1高表達對胃癌的發生、發展、轉移、侵襲至關重要[23-25]。Xi等[26]發現GLUT-1在喉癌中表達上調，下調GLUT-1會抑制喉癌的增殖和轉移。Yang等[27]通過薈萃分析發現GLUT-1與直腸癌T分期、淋巴結轉移等臨床病理特征呈正相關，提示GLUT-1過表達可能是結直腸癌預后不良的潛在生物學標志物。PKM2是丙酮酸激酶最常見的亞型，是糖酵解重要的調節點，通過將高能磷酸基團轉移到ADP中，使磷酸烯醇丙酮酸轉化為丙酮酸，從而生成ATP。PKM2被認為是腫瘤生長及代謝的重要調節因子，有研究表明在胃癌中敲除PKM2后抑制糖酵解水平，抑制了腫瘤細胞的增殖[28-31]。Kim等[32]發現細胞外PKM2激活EGFR-PKC導致CLDN1表達增強，從而促進結腸癌細胞的遷移能力。LDHA通過催化丙酮酸轉化為乳酸促進糖酵解過程，降低腫瘤微環境的pH值，在胃癌中表達上調，促進腫瘤的遷移、侵襲[33]。Cai等[34]發現LDHA在口腔鱗狀細胞癌中過表達，通過促進癌基因和上皮-間質轉化促進口腔鱗狀細胞癌進展。本實驗通過對GLUT-1、PKM2、LDHA在胃腺癌中的表達及與胃腺癌臨床病理特征的相關性進行分析，發現GLUT-1、PKM2、LDHA均在胃腺癌中高表達，且GLUT-1、PKM2表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移等相關。由此可見，胃癌中存在較高的糖酵解水平，產生有利于腫瘤生長的酸性微環境，促進腫瘤的發生、發展。

新近研究表明，CLDN9與腫瘤糖代謝具有相關性。Wang等[6]通過分析TCGA數據庫中548例子宮內膜癌患者mRNA表達水平，發現CLDN9等9個基因與子宮內膜癌糖酵解水平及總生存率密切相關。Kang等[7]通過數據庫分析CLDN9與食管腺癌糖酵解相關，常會導致預后不良。本實驗結果顯示胃腺癌組織中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA表達呈正相關，且在CLDN9陽性組中GLUT-1、PKM2、LDHA的表達均高于CLDN9陰性組。因此，我們認為CLDN9表達與胃癌糖代謝相關，為胃癌進展及轉移機制研究提供理論支持。

CLDN9不僅與腫瘤細胞的增殖、侵襲有關，其高表達還會影響患者預后[35]。影響胃癌患者預后的因素諸多，有研究表明脈管侵犯可作為晚期胃癌及非轉移胃癌患者預后的獨立危險因素，且神經侵犯與胃癌不良預后關系密切[36-38]。本組結果表明CLDN9、PKM2、LDHA、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移均與患者預后相關，且CLDN9陽性者的生存率明顯低于陰性者，與生物信息學分析結果一致；Cox回歸模型分析顯示CLDN9、PKM2、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經侵犯是胃腺癌預后的獨立危險因素。由此推測，高表達的CLDN9影響腫瘤的生物學行為，參與腫瘤糖酵解的調控，抑制其表達可能會延長患者生存時間，改善患者預后。CLDN9有望成為提示胃癌患者預后不良的生物學標志物，對臨床治療策略有一定的指導意義，但其生物學機制仍需要進一步分析。

總之，本實驗結果表明CLDN9、GLUT-1、PKM2及LDHA在胃腺癌組織中表達上調，CLDN9、GLUT-1及PKM2表達均與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理特征有關，且CLDN9、PKM2作為胃腺癌預后的獨立危險因素，其高表達提示患者預后不良。CLDN9表達可能與腫瘤糖代謝相關，在胃癌進展中起重要作用，有望成為胃癌診斷和治療的新靶點。