lncRNA PURPL通過調控miR-367-3p/MTA3軸抑制腎癌細胞的增殖和侵襲

楊凌博，孫建濤，魯帥奇，武新超，李小輝

腎癌的發病率在泌尿生殖系統腫瘤中位居第2位，是常見的腎臟惡性腫瘤[1]。早期腎癌的治療取得較大進展，然而中晚期腎癌的療效依然較差，腎癌細胞高度增殖活性及侵襲導致中晚期腎癌患者預后不良[2-3]。目前，腎癌增殖和侵襲的機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成，在腎癌、胃癌等惡性腫瘤的發生、發展中起決定性作用[4-5]。PURPL是新近發現的lncRNA，參與調控肝癌、胃癌、結直腸癌等腫瘤細胞的增殖和轉移，其表達高低與腫瘤的大小和組織學分級相關[6-8]。PURPL在腎癌組織中的表達水平、具體作用及調控機制尚待闡明。本文旨在探討PURPL在腎癌組織和細胞系中的表達，明確PURPL通過調控miR-367-3p/MTA3分子軸對腎癌細胞增殖和侵襲的影響，為尋找新的腎癌治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2018年1月～2020年8月我院泌尿外科手術切除的67例腎癌組織，均為腎透明細胞癌。其中男性39例，女性28例；年齡26～83歲，平均63.23歲。根據2010年美國癌癥聯合會TNM分期標準：Ⅰ期43例，Ⅱ期23例；根據Fuhrman組織學分級：Ⅰ級23例，Ⅱ級29例，Ⅲ級9例，Ⅳ級6例。另收集距離腫瘤邊緣>2 cm的癌旁組織作為對照。腫瘤組織和癌旁組織均經兩名以上病理醫師證實，標本均凍存于液氮，患者術前均無放、化療及免疫治療史。本實驗經我院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞與試劑 腎癌細胞系和正常腎小管上皮細胞，購于中國典型培養物保藏中心。陰性對照慢病毒、PURPL慢病毒、miR-367-3p mimic、miR-NC mimic、PURPL野生型報告基因(PURPL-WT)與突變型報告基因(PURPL-MUT)，均購于上海吉瑪公司。TRIzol試劑和Lipofectamine 2000，購于美國Invitrogen公司。MTT試劑盒購于南京凱基公司。qRT-PCR試劑盒和引物，購于南京建成生物研究所。胎牛血清、DMEM培養基、RPMI 1640培養基，購于美國Hyclone公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒，購于美國Promega公司。一抗(MTA3、Cyclin A、CDK2、Zeb-2、GAPDH、Snail)和辣根過氧化物酶標記二抗，購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，HK-2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，常規培養于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。OS-RC-2細胞進入對數生長期后，胰酶消化并接種到6孔板，實驗分組：對照組和PURPL組分別感染陰性對照慢病毒和PURPL慢病毒，感染復數(MOI)均為40；感染48 h后進行后續實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測PURPL、miR-367-3p與MTA3 mRNA的表達 采用TRIzol試劑提取組織及細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。根據qRT-PCR試劑盒說明書建立反應體系，以GAPDH和U6作為內參照。qRT-PCR檢測PURPL正向引物：5’-TTCTACCGCAATTCGATGGAGTCTTG-3’，反向引物：5’-GAGGCAGGAGAATGGCGTGA-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-367-3p正向引物：5’-CGAGCAATTGCACTTTAGCAAT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH正向引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反向引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’；MTA3正向引物：5’-TCCTCCAGCAACCCATACCT-3’，反向引物：5’-TCGGTCAAGTCAGCCTCAAC-3’。qRT-PCR運行參數：95 ℃ 50 s，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合計35個循環。采用2-ΔΔCt方法計算PURPL、miR-367-3p和MTA3 mRNA表達水平。

1.2.3MTT法檢測OS-RC-2細胞活力 收集對數生長期的OS-RC-2細胞，調整細胞密度至每毫升1×104個細胞，取150 μL細胞懸液加入96孔板。取20 μL MTT試劑加入每孔，培養箱內培養4 h。吸去培養基后，取120 μL二甲基亞砜加入各孔，利用振蕩器充分振蕩。利用酶標儀在波長450 nm處測量每孔光密度(OD)值。每天檢測OS-RC-2細胞活力，連續檢測5天。

1.2.4Transwell實驗檢測OS-RC-2細胞侵襲 在Transwell小室預鋪基質膠，用不含胎牛血清的培養基調整對數生長期的OS-RC-2細胞密度至每毫升1×105個細胞，取150 μL細胞懸液加入Transwell小室，取550 μL含胎牛血清的培養基加入下室。培養24 h，取出Transwell小室并用棉簽擦去未穿過上室的細胞，利用甲醇進行固定，利用結晶紫染液進行染色，流水清洗并晾干，顯微鏡(×100)下觀察、拍照、計數。

1.2.5生物信息學技術預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證PURPL的潛在分子機制 利用starBase v 2.0數據庫預測PURPL結合的miRNA。收集對數生長期的OS-RC-2細胞接種至96孔板，根據Lipofectamine 2000說明書進行轉染，將PURPL-WT與PURPL-MUT及miR-367-3p mimic或miR-NC mimic共轉染至OS-RC-2細胞中，轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測OS-RC-2細胞的相對熒光素酶活性。

1.2.6Western blot法檢測MTA3蛋白表達 收集對數生長期的OS-RC-2細胞，利用RIPA裂解液提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后，在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至硝酸纖維素膜。在5%脫脂牛奶中封閉，加入一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育3 h，配置ECL試劑，在凝膠成像系統中曝光、顯影。

2 結果

2.1 腎癌和癌旁組織中PURPL的表達水平PURPL在腎癌和癌旁組織中表達分別為0.40±0.14和1.61±0.21，癌旁組織的PURPL表達是腎癌組織的4.03倍，明顯高于腎癌組織(P<0.01，圖1)。

圖1 腎癌組織和癌旁組織中PURPL表達水平

2.2 腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中PURPL表達水平腎癌ACHN、786-O、A498、Caki-1、OS-RC-2細胞中PURPL的表達分別為0.53±0.08、0.66±0.06、0.41±0.03、0.77±0.05、0.13±0.03，明顯低于正常腎小管上皮細胞HK-2(1.00±0.05)，差異有統計學意義(P均<0.05，圖2)，OS-RC-2細胞中PURPL表達水平最低(P<0.01)，故選擇OS-RC-2細胞進行后續實驗。

圖2 腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中PURPL表達水平

2.3 對照組和PURPL組OS-RC-2細胞中PURPL的表達水平熒光顯微鏡顯示慢病毒感染成功。qRT-PCR結果顯示，PURPL組和對照組OS-RC-2細胞中PURPL表達分別為16.26±3.10和1.02±0.12，差異有統計學意義(P<0.01，圖3)，表明PURPL過表達成功。

圖3 OS-RC-2細胞中PURPL的表達水平：A.對照組(普通顯微鏡)；B.PURPL組(普通顯微鏡)；C.對照組(熒光顯微鏡)；D.PURPL組(熒光顯微鏡)

2.4 過表達PURPL對OS-RC-2細胞增殖活力的影響MTT法結果顯示，48 h后PURPL組OS-RC-2細胞增殖活力明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。

圖4 MTT檢測PURPL對OS-RC-2細胞增殖活力的影響

2.5 過表達PURPL對OS-RC-2細胞侵襲的影響Transwell實驗顯示，對照組和PURPL組OS-RC-2細胞侵襲數分別為(71.53±6.23)個和(26.87±3.88)個；與對照組相比，過表達PURPL可明顯抑制OS-RC-2細胞侵襲(P<0.01，圖5)。

圖5 Transwell實驗檢測PURPL對OS-RC-2細胞侵襲能力的影響：A.Transwell實驗檢測PURPL對腎癌細胞侵襲的影響；B.細胞侵襲數的半定量分析

2.6 生物信息學技術預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證PURPL的潛在機制利用starBase v2.0數據庫預測miR-367-3p可能是PURPL的靶基因(圖6)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，通過共轉染miR-367-3p mimic和靶向位點無突變的PURPL-WT載體使OS-RC-2細胞中熒光素酶活性明顯下降(P<0.01)，而共轉染miR-367-3p mimic和靶向位點突變的PURPL-MUT載體對熒光素酶活性無顯著作用(P>0.05，圖7)，提示miR-367-3p是PURPL的靶基因。

圖6 生物信息學技術預測PURPL的潛在機制

圖7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-367-3p和PURPL的靶向關系

2.7 過表達PURPL的OS-RC-2細胞中miR-367-3p和MTA3 mRNA表達變化qRT-PCR檢測顯示，對照組和PURPL組OS-RC-2細胞miR-367-3p的表達分別為1.04±0.16和0.23±0.08，過表達PURPL顯著下調miR-367-3p的表達(P<0.01)。對照組和PURPL組OS-RC-2細胞MTA3 mRNA的表達分別為1.01 ± 0.06和5.49 ± 1.16，過表達PURPL顯著上調MTA3 mRNA的表達(P<0.01)。

2.8 過表達PURPL促進MTA3蛋白表達Western blot結果顯示，過表達PURPL后OS-RC-2細胞中MTA3蛋白表達明顯增加，細胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表達明顯降低，細胞侵襲蛋白如Zeb-2、Snail表達明顯降低，提示OS-RC-2細胞的增殖和侵襲能力明顯降低(圖8)。

圖8 Western blot法檢測MTA3蛋白及細胞功能蛋白的表達：A.Western blot實驗；B.蛋白表達灰度值分析

3 討論

lncRNA參與調控染色質修飾、轉錄抑制及激活、核內運輸等途徑，影響基因的表達[9]。隨著測序技術的進步，lncRNA已成為腎癌研究領域的新熱點[10]。最新文獻報道，lncRNA是腎癌增殖和轉移過程的關鍵調控因子[11-12]。Cai等[13]研究表明，lncRNA PCGEM1主要位于細胞質，其在腎癌細胞中表達升高，沉默lncRNA PCGEM1可抑制腎癌的細胞增殖和遷移，miR-433-3p是lncRNA PCGEM1的靶基因。Hu等[14]研究表明，MSC-AS1在腎癌組織中顯著上調，與腎癌患者的預后不良相關，降低MSC-AS1表達可通過促進miR-3924表達抑制腎癌細胞的增殖和遷移特性。lncRNA在不同腫瘤細胞中表現為不同的表達模式，因此在不同腫瘤細胞中的作用不同[15]。研究發現，PURPL能夠顯著調控結直腸癌細胞的增殖和轉移能力[8]。目前，PURPL在腎癌中的表達、功能及調控機制尚不清楚。本組發現在腎癌組織和細胞系中PURPL的表達明顯下調，上調PURPL能夠抑制腎癌細胞的增殖和侵襲，提示PURPL在腎癌細胞中發揮抑癌功能。

lncRNA可特異性與相應miRNA互補結合，發揮“分子海綿”作用，抑制miRNA對其靶基因的調控作用[16-17]。本組采用starBase v2.0預測顯示，PURPL與miR-367-3p存在潛在的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗驗證PURPL共價靶向miR-367-3p。最近研究表明，miR-367-3p在非小細胞癌、骨肉瘤、腎透明細胞癌等多種腫瘤中高表達，顯著促進腫瘤細胞生長和轉移，發揮明顯的癌基因功能[18-19]。miR-367-3p在腎癌組織和細胞系中表達增加，下調miR-367-3p顯著抑制腎癌細胞的增殖和轉移，MTA3基因是miR-367-3p在腎癌中的直接靶基因[20]。qRT-PCR和Western blot結果顯示，上調PURPL可顯著抑制miR-367-3p的表達，miR-367-3p表達下調可顯著促進MTA3基因的表達。以上實驗結果表明，PURPL可能作為miR-367-3p的“分子海綿”調節MTA3基因的表達，進而調控腎癌的發生、發展。Western blot結果顯示，上調PURPL后細胞增殖蛋白如Cyclin A、CDK2表達顯著減少，細胞侵襲蛋白如Zeb-2、Snail表達顯著減少，提示OS-RC-2細胞增殖和侵襲能力明顯降低。PURPL在體內對腎癌細胞增殖和侵襲的影響尚不明確，本課題組下一步將通過動物實驗對PURPL在體內的作用進行驗證。

綜上所述，lncRNA PURPL在腎癌組織和細胞系中表達下調，PURPL通過下調miR-367-3p促使MTA3表達上調，從而抑制腎癌OS-RC-2細胞的增殖和侵襲。PURPL/miR-367-3p/MTA3軸有望成為腎癌治療的標志物和有效靶點。