高海拔地區不同抗原修復法對免疫組化染色的影響

徐開敏，陳 蕓，孟慶印

抗原修復是免疫組化技術中最關鍵的步驟[1]。近年隨著各醫院病例大幅增多，病理技術對免疫組化自動化的需求也日益顯著。云南省為高海拔地區，我院地處海拔1 900 m，常壓下水的沸點為94.3 ℃。全自動免疫組化染色儀均無高壓功能，抗原修復溫度最高只能達到水的沸點。受高海拔和抗原修復溫度影響，云南省免疫組化自動化發展較慢，使用全自動免疫組化染色儀的單位極少。隨著科技的發展，一些新技術和新產品的出現，逐漸解決了高海拔地區對免疫組化自動化發展的限制。本文采用不同抗原修復方法進行實驗，以尋找高海拔地區的最佳染色方法，提高免疫組化的準確性和可靠性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年1月～2021年1月云南省腫瘤醫院病理科乳腺癌、肺癌、直腸癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌石蠟樣本合計100例，切片厚4 μm。

1.2 試劑Lumatas全自動免疫組化染色儀、抗原修復液、一抗、檢測系統，均購自福州邁新公司。

1.3 方法選用科室常用的100種抗體作為測試對象，每種陽性組織切片各切4份，隨機分為微波組、水煮組、高壓組、儀器組。其中，儀器組的免疫組化染色由儀器自動完成；微波組、水煮組、高壓組均為手工操作，抗原修復液均為EDTA(pH 9.0)。采用溫度探測器測試微波組、水煮組、高壓組、儀器組最高抗原修復溫度分別為89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，抗原修復時間分別為20、20、1.5、20 min。手工免疫組化染色步驟：組織經脫蠟、水化、抗原修復后滴加50 μL過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL一抗，室溫孵育60 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL DAB，室溫孵育5 min，自來水沖洗，蘇木精復染，中性樹膠封固。

2 結果

2.1 抗體敏感度比較實驗結果顯示，100種抗體染色強度從高到低排序：高壓組>儀器組>水煮組>微波組(表1)。微波組假陰性率為10%，水煮組假陰性率為3%，且其它抗體的染色強度明顯弱于高壓組。儀器組的染色強度介于水煮組和高壓組之間(圖1)。

圖1 不同抗原修復對TdT染色強度的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖2 不同抗原修復對CK7背景著色的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖3 不同抗原修復對ER脫片的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖4 不同抗原修復對p63皺褶的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組

表1 不同抗原修復對免疫組化染色的影響

2.2 抗體特異性比較實驗結果顯示，EDTA高壓組中部分抗體出現背景染色，如PR、CD68、CD3、S-100、GST-π、p120、Calponin、CD99、EGFR、Lysozyme、Catenin-β、Glypican-3。其它組背景相對比較干凈(圖2)。

2.3 組織學形態比較實驗結果顯示，高壓組中部分組織出現局部脫片(圖3)、皺褶(圖4)等現象，其它組暫未發現脫片、皺褶等現象。

3 討論

目前，常用的抗原修復方式：熱修復、酶修復。常用抗原修復液：EDTA、檸檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等[2]。隨著一抗制備技術的發展，必須使用胰酶和胃酶修復的抗體逐漸被熱抗原修復的抗體取代[3]。為便于操作，越來越多的病理技術人員將一抗采用“一鍋煮”的方式進行抗原修復，而不再采用多種抗原修復液分開進行抗原修復[4]。

不同種類修復液的整體修復效果趨勢為pH 6.0～9.0范圍內，抗原修復液pH值越高，免疫組化染色結果越強[5]；采用低pH值的抗原修復液，免疫組化染色背景較干凈，細胞形態較好[6]。采用相同的抗原修復液，其它條件相同的情況下，抗原修復溫度越高，免疫組化染色結果越強[7]。本實驗結果中微波組、水煮組、高壓組、儀器組最高抗原修復溫度分別為89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，所獲得免疫組化染色強度與抗原修復溫度呈正相關。目前，國內免疫組化試劑公司地址均為非高海拔地區，其質控的抗原修復為正常方式。高海拔地區受海拔影響，采用非高壓方式進行抗原修復時，抗原修復溫度會偏低，抗原決定簇暴露不充分[8]。若其它免疫組化染色條件，如試劑孵育采用試劑公司推薦的條件，免疫組化染色結果可能會整體偏弱[9]。當某些組織中某種抗原含量較低，或某種抗體的親和力或敏感性較低時，可能造成假陰性結果[10]。本實驗也驗證了該結果，核表達的抗體對抗原修復溫度要求較高，抗原修復溫度較低時，親和力和敏感性較低的核表達抗體出現假陰性的概率較大，如BCL-6、ERCC1、WT1、TDT、Rb Gene、PMS2、MLH1等。

綜上所述，抗原修復方法是否恰當，直接影響免疫組化抗體的表達效果。對于高海拔地區，建議采用以下方法避免免疫組化假陰性：(1)選擇EDTA高壓1～2 min進行抗原修復；(2)加強一抗孵育條件，如延長一抗孵育時間或提高一抗孵育溫度至37 ℃；(3)采用濃縮型試劑的病理科，可根據預實驗結果適當提高一抗濃度；(4)采用具有低壓加熱功能的全自動免疫組化染色儀。