結核性腦膜炎患者血清神經細胞黏附分子1與轉甲狀腺素蛋白的表達及臨床意義研究

吳云虹，周少瓏*，王景，蔡奕秋，林雅明

結核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是肺外結核疾病中嚴重的類型之一，由結核分枝桿菌感染中樞神經系統引起，可導致腦膜、脈絡叢和室管膜炎性反應、腦積水、顱內壓增高甚至腦疝，臨床病死率高，存活者易遺留神經系統后遺癥［1］。TBM 起病隱匿，病程長，癥狀輕重不一，臨床診斷和治療困難，早期發現和診斷是改善TBM 預后的關鍵［2］。神經細胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM1）是免疫球蛋白分子超家族中的細胞黏附家族分子，主要在神經系統中表達，參與調節神經細胞的功能和神經元遷移以及神經損傷后的突觸重組，與神經系統疾病存在密切關系［3］。轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）是一種甲狀腺激素結合蛋白，可將甲狀腺素從血液輸送到大腦，TTR 功能異常可導致心肌病、自主神經疾病以及神經系統疾?。?］。而NCAM1、TTR 與TBM 是否存在關聯尚不完全清楚。本研究擬探討NCAM1、TTR 與TBM 的關系，旨在為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年3 月至2020 年12 月三亞市人民醫院和三亞市中心醫院收治的114 例TBM 患者為TBM 組，其中男67 例、女47 例，年齡27～46 歲，平均年齡（35.3±7.0）歲。選擇同期于三亞市人民醫院和三亞市中心醫院體檢中心體檢的46 例健康志愿者為對照組，其中男29 例、女17 例，年齡26～48 歲，平均年齡（35.3±7.1）歲。兩組均排除神經系統疾病、顱內感染、顱內腫瘤等疾病。TBM 組和對照組的性別構成、平均年齡比較，差異無統計學意義（χ2=0.249，t=0.033，P>0.05）。

1.2 TBM 患者納入與排除標準 納入標準：（1）符合《內科學》［5］中的腦膜炎診斷標準；（2）腦脊液常規培養分離出結核分枝桿菌［6］；（3）年齡18 周歲以上。排除標準：（1）細菌、病毒性腦膜炎；（2）癲癇、腦梗死、腦出血；（3）阿爾茨海默病、帕金森、血管性癡呆等；（4）腦膜癌??；（5）隨訪失聯。

1.3 TBM 患者分期 根據英國醫學研究理事會（MRC）分期標準［7］，將患者分為Ⅰ期（無局灶神經系統損傷體征）31 例、Ⅱ期（腦膜刺激征、輕度感覺和運動功能異常）45 例、Ⅲ期（驚厥或抽搐、昏睡或昏迷）38 例。本研究經三亞市人民醫院倫理委員會批準（批準號：201711053）。TBM 組患者或其家屬及對照組均對本研究知情同意并簽署同意書。

1.4 實驗室檢查 TBM 組在入組當日（基線）、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪1 年時分別采集靜脈血、腦脊液。對照組在體檢當日（基線）僅采集靜脈血。干燥試管（3 ml）血標本室溫下靜置30 min 后取上清液離心（離心半徑13.5 cm，轉速 2 000 r/min）10 min，收集血清于-80 ℃冷凍保存備檢，抗凝試管標本混勻后直接上機檢測。腦脊液收集于專用標本瓶待檢。取血清樣本復溶，采用Multiskan FC 酶標儀（美國賽默飛公司）、酶聯免疫吸附試驗檢測血清NCAM1、TTR 水平，試劑盒購自美國賽默飛公司。DxH 800 全自動血細胞分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測外周血白細胞計數、腦脊液有核細胞數、有核細胞/單核細胞比值。采用DxC 800 全自動生化儀系統（美國貝克曼庫爾特公司）檢測血清白蛋白、血鈉、血鉀水平。

1.5 觀察指標 收集TBM 組年齡、性別、合并疾病（糖尿病、艾滋病、肺結核）、既往病史（結核患者接觸史、結核病史）、入院癥狀（體質量減輕、意識改變、癲癇、認知功能障礙）、入院生命體征（心率、呼吸、收縮壓和舒張壓）、入院體格檢查（顱神經麻痹、腦膜刺激征、外周神經功能異常）、影像學檢查（腦積水、腦梗死病灶、結核瘤）、MRC 分期、住院時間、發病至抗結核治療時間、和實驗室檢查指標。

TBM 組患者均接受抗結核治療，治療結束后隨訪1 年，根據改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS）［8］評估神經預后：0 分，完全無遺留癥狀；1 分，有遺留癥狀，但無功能障礙；2 分，遺留輕度殘疾；3 分，中度殘疾；4 分，中重度殘疾；5 分，重度殘疾；6 分，死亡。0～2 分為預后良好（63 例），≥3 分為預后不良（51 例）。

1.6 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，經Shapiro-Wilk 檢驗符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，重復測量數據比較采用重復測量方差分析。偏態計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料以相對數表示，采用χ2檢驗。采用多因素Logistic 回歸分析探討TBM預后的影響因素，繪制NCAM1、TTR 預測TBM 患者預后的受試者工作特征（ROC）曲線，采用DeLong 檢驗比較ROC 曲線下面積。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較 TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 1 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels between healthy physical examinees and tuberculous meningitis patients

表1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 1 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels between healthy physical examinees and tuberculous meningitis patients

注：TBM=結核性腦膜炎，NCAM1=神經細胞黏附分子1，TTR=轉甲狀腺素蛋白

2.2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR水平比較 Ⅲ期TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平低于Ⅱ期和Ⅰ期TBM 患者，差異有統計學意義（P<0.05）；Ⅱ期TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平低于Ⅰ期TBM患者，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 2 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients by the stage distinguished by British Medical Research Council staging system

表2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 2 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients by the stage distinguished by British Medical Research Council staging system

注：a 表示與Ⅰ期比較P<0.05，b 表示與Ⅱ期比較P<0.05

2.3 不同預后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平變化 組間與時間對不同預后TBM 患者血清NCAM1、TTR水平存在交互作用（P<0.05），組間及時間分別對血清NCAM1、TTR 水平主效應顯著（P<0.05），其中預后不良TBM 患者基線、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月血清NCAM1、TTR 水平均低于預后良好TBM 患者（P<0.05），見表3。

表3 不同預后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平差異（±s，mg/L）Table 3 Differences of serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients with good and poor prognosis

表3 不同預后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平差異（±s，mg/L）Table 3 Differences of serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients with good and poor prognosis

注：a 表示與預后良好比較P<0.05

2.4 影響TBM 患者預后的因素分析 預后不良TBM 患者的年齡、意識改變、認知功能障礙、顱神經麻痹、腦積水比例、住院時間、腦脊液有核細胞數、腦脊液有核細胞/單核細胞比值高于預后良好TBM 患者，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組MRC 分級比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。將上述有統計學差異的指標納入多因素Logistic 回歸分析，以ENTER 法篩選變量，結果顯示MRC 分期為Ⅲ期是TBM 患者預后不良的危險因素（P<0.05），基線高水平NCAM1、TTR 是TBM 患者預后不良的保護因素（P<0.05），見表5。

表4 TBM 患者預后影響因素的單因素分析Table 4 Univariate analysis of associated factors for prognosis in tuberculous meningitis patients

表5 TBM 患者預后影響因素的多因素Logistic 回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of prognostic factors in tuberculous meningitis patients

2.5 基線NCAM1、TTR 預測TBM 患者預后的價值分析 基線NCAM1、TTR 預測TBM 患者預后不良的截斷值為210.15 mg/L、125.36 mg/L，ROC 曲線下面積為0.665、0.689，聯合（基線NCAM1+基線TTR）（結合多因素Logistic 回歸分析計算聯合預測值）預測TBM 患者預后的ROC 曲線下面積為0.879，高于單獨基線NCAM1、TTR 的ROC 曲線下面積（Z=4.428、3.941，P<0.001），見圖1 和表6。

圖1 基線NCAM1、TTR 預測TBM 患者預后的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients

表6 基線NCAM1、TTR 預測TBM 患者預后的效能Table 6 Efficacy of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients

3 討論

TBM 是一種高死亡率和高致殘率的神經系統感染性疾病，盡管接受了足夠療程的抗結核治療，但成年TBM患者預后依然很差［9］。結核分枝桿菌通過淋巴系統或血液運輸至全身，并跨越血-腦脊液屏障進入中樞神經系統，直接感染小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元，導致白介素6、腫瘤壞死因子α 等多種致炎細胞因子分泌和活性氧生成，介導炎性反應，進一步增加血-腦脊液屏障通透性，引起腦脊液白細胞增多、蛋白質積累和腦膜炎癥，且細菌負荷持續存在與腦膜炎病理程度加重密切相關［10］。目前TBM 的診斷主要結合臨床癥狀、腦脊液實驗室檢查和顱腦影像學檢查等，腦脊液病原學診斷是TBM 實驗診斷的金標準，但培養時間長（42 d）、培養成本高，容易導致病情延誤，TBM 的治療目前仍是基于肺結核治療方案，由于血-腦脊液屏障滲透性差，可能導致腦脊液中的藥物濃度不理想，治療效果不佳［11］。因此迫切需要探討與TBM 密切相關的生物標志物。

NCAM1 是一種多功能跨膜蛋白，位于人類11 號染色體（11q23.1），主要在神經元和神經膠質細胞中表達，介導神經細胞的識別和黏附，參與突觸可塑性、中樞神經發育和神經發生，NCAM1 功能障礙會損害突觸形成、突觸活動和可塑性［12-13］?，F有研究發現NCAM1 異常表達與雙相情感障礙、精神分裂癥有關［12］，自閉癥譜系障礙患兒血漿 NCAM1 水平明顯降低，且NCAM1 水平與社會動機、社會交流和社會反應呈負相關［13］。NCAM1還可通過與S100A9 淀粉樣蛋白相互作用，以濃度依賴性方式促進 S100A9 淀粉樣蛋白觸發的級聯反應和神經炎性反應，參與神經退行性疾病［14］，與空間記憶受損和認知功能障礙有關［15］。NCAM1 與TBM 的報道十分少見，本研究發現TBM 患者基線血清NCAM1 水平明顯降低，且隨著TBM 病情加重而降低，預后不良患者血清NCAM1 水平在基線、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月時均低于預后良好患者，多因素Logistic 回歸分析結果顯示NCAM1 與TBM 預后不良有關，表明NCAM1 缺失可能與TBM 發病和病情進展有關，分析原因可能為：結核分枝桿菌顱內感染引起神經細胞損傷，導致NCAM1 合成減少，NCAM1 缺失可進一步影響受損神經組織修復和新生神經發生，加重病情進展。ROC 曲線分析結果顯示NCAM1 預測TBM 患者預后不良的ROC 曲線下面積為0.665，可以看出NCAM1預測TBM 患者預后不良具有較高的效能，提示NCAM1有望作為TBM 預后預測的潛在標志物。

TTR 是甲狀腺素和視黃醇的載體蛋白，位于人類18號染色體（18q11.2-12.1），由肝臟或脈絡叢產生后易位到血液或腦脊液中，以四聚體形式存在，負責運輸甲狀腺素和視黃醇［16］。TTR 作為載體蛋白通過與淀粉樣蛋白β（Amyloid beta，Aβ）寡聚體結合抑制新 Aβ 聚集體的生長和形成，降低細胞毒性。TTR 結構突變會降低蛋白質的穩定性，導致四聚體的不穩定性和分解，形成淀粉樣TTR 聚集體，沉積到組織和神經元中并誘導細胞毒性作用，引起不同淀粉樣變疾病，由此TTR 被認為是淀粉樣變性的生物學標志物［17］。本研究發現TBM 患者基線血清TTR 水平降低，且預后不良患者不論在基線還是入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月時血清TTR 水平均低于預后良好患者，說明低水平TTR 與 TBM 神經系統損害加重和預后不良有關。腦膜炎大鼠模型可觀察到大腦皮質Aβ1～42 表達增高和神經膠質細胞活化，這與神經認知功能衰退和腦膜炎后遺留神經系統后遺癥有關［18］，而TTR 可切割 Aβ形成活性較低的短肽，降解已經聚集的Aβ 肽，TTR 正常表達下，Aβ 聚集減少并且 Aβ 的毒性被消除［19-20］，說明TTR 可通過抑制Aβ 活性和沉積，預防腦膜炎引起的淀粉樣變性，減輕神經組織損傷，而TTR 減少后其對Aβ 活性抑制作用降低，導致腦膜炎后神經元損傷和神經預后不良。本研究結果顯示TTR 預測TBM 患者預后不良的ROC 曲線下面積為0.689，說明TTR 具有預測TBM 患者預后的效能，但是靈敏度和特異度均偏低，兩者聯合后預測效能明顯提高，可為TBM 預后判斷提供更可靠的信息。

本研究多因素Logistic 回歸分析結果顯示MRC 分期Ⅲ期是TBM 患者預后不良的危險因素，說明TBM 神經損傷越重，患者遺留神經系統后遺癥的可能性越大，臨床對于Ⅲ期患者應提高警惕，優化治療方案，以避免神經預后不良的發生。

綜上，TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平均降低，NCAM1、TTR 水平低下與TBM 發生和病情加重有關。NCAM1、TTR 缺乏可能通過加重神經系統損傷參與TBM發病和進展過程，聯合兩項指標診斷TBM 具有更高的效能。

本研究不足之處在于樣本例數偏少，可能導致統計學偏倚，該結論尚待進一步擴大樣本例數加以探討；尚未納入其他腦膜炎病例，NCAM1、TTR 是否可鑒別TBM 和其他類型腦膜炎尚不完全清楚，仍需進一步招募其他類型腦膜炎病例加以證實。

作者貢獻：吳云虹負責設計研究方案，實施研究，論文撰寫；周少瓏提出研究思路，分析試驗數據，審核論文，對論文整體負責；王景負責實施研究，資料搜集整理，論文修改；蔡奕秋進行統計學分析；林雅明負責課題設計，論文撰寫。

本文無利益沖突。