黃連等五種中藥顆粒劑對鮑曼不動桿菌生物膜耐藥性及相關基因的作用分析*

李曉君，鄧超，譚俊青，林渝渠，賴韶欽，何宇巍

1 廣東省第二中醫院 廣東廣州 510095

2 中山大學南方學院 廣東廣州 510970

3 廣州市登峰街社區衛生服務中心 廣東廣州 510095

鮑曼不動桿菌是一種非發酵型的革蘭陰性條件致病菌，近年來報道顯示，鮑曼不動桿菌的分離菌株數已超過銅綠假單胞菌，成為不發酵糖革蘭陰性桿菌分離最多的菌[1-2]，在2018年CHINET監測結果顯示，碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（Carbapenem resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的檢出率大于75%，因此被國內外知名專家列為目前重要的'超級細菌'，成為醫學治療中的一個嚴重問題[3]。

細菌生物膜是一種膜狀細菌群體，生物膜的形成是鮑曼不動桿菌的重要耐藥機制之一[4]，報道顯示臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株有較強的生物膜形成能力[5]，細菌一旦形成生物膜，其對抗菌藥物的敏感性大大降低，細菌將很難被殺滅[6]。

中藥在抑殺菌方面有其獨特的效果，中藥顆粒劑作為新型中藥制劑，并因其便捷﹑耐藥性少的特點，迅速被接受。我們在前期的研究發現，黃連﹑黃芩﹑五味子﹑烏梅﹑連翹對CRAB具有良好的抑菌效果及抑膜作用[7-9]，為進一步探索相關中藥顆粒劑抑膜機制，本實驗擬通過瓊脂糖凝膠電泳技術測定18對常見耐藥基因以及MIC法測定藥物敏感試驗在藥物作用前后的改變，以期在分子學的角度進一步探索中藥顆粒劑抑菌的機制，為臨床用藥提供數據參考。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 菌株 收集廣東省第二中醫院檢驗科于2020年10月—2021年1月臨床分離的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌，剔除同一病人分離的同一菌株，進行生物膜體外模型篩選實驗，根據實驗實際情況，使用結晶紫染色法觀察細菌生物膜體外模型情況挑選出2株生物膜陽性菌株（命名為PF-Q，PF-R），1株生物膜陰性菌株進行實驗（命名為PF-N）。

1.2 主要儀器與試劑 普通營養肉湯﹑血瓊脂平板購于廣州市迪景微生物科技有限公司。黃連﹑黃芩﹑五味子﹑烏梅﹑連翹5種中藥顆粒劑均購于廣東一方制藥有限公司。主要儀器為法國梅里埃VITEK2全自動微生物鑒定/藥敏儀，新加坡ESCO AC2-3S1生物安全柜，美國Bio-Rad IQTM5型熒光定量PCR儀。

2 檢測方法

2.1 篩選實驗菌株 使用結晶紫染色法進行染色，在低倍鏡下觀察生物膜形成，選擇生物膜形成陽性的菌株作為實驗菌株。

2.2 確定抑膜濃度 采用倍比稀釋的方法檢測CRAB的最小抑膜濃度。

2.3 耐藥基因檢測

2.3.1 DNA模板制備 按照細菌基因組DNA提取試劑盒，提取待測細菌基因組。

2.3.2 PCR擴增 引物序列參照表1，引物的設計合成擎科新業生物公司合成，使用rTaq酶配制25 μL的PCR 反應體系對目的基因進行擴增，反應體系：10×rTaq Buffer2.5μL，dNTP Mixture2.0μL，上游引物（10 μmol/mL）0.5μL，下 游 引 物（10 μmol/mL）0.5μL，rTaq（5 U/μL）0.125μL，DNA1.0。PCR運行參數為95℃預變性5 min，95℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min。

表1 檢測耐藥基因引物序列

2.3.3 PCR產物分析 以DL2000 DNA Marker分子量標準做為參考，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統查看結果并分析。

2.4 抗菌藥物敏感性實驗 將3株CRAB（2個生物膜陽性，1個陰性）進行藥物實驗，3株抑膜亞濃度實驗菌液轉種血平板，使用VITEK2全自動微生物鑒定/藥敏儀進行藥敏檢測。

結 果

1 耐藥基因檢測 在擴增的18對耐藥基因中

floR基因﹑arm基因﹑sul基因三對耐藥基因實驗結果陽性，見表2，圖1-3。

圖1 flo基因擴增產物電泳圖像

表2 各菌株耐藥基因檢測情況表

2 藥物實驗前后的藥敏結果

將最小抑膜亞濃度的CRAB進行藥敏試驗，得到以下結果，見表3。

表3 黃連等五種中藥顆粒對CRAB作用前后藥敏改變

討 論

鮑曼不動桿菌，作為重要的醫院病原體出現[10]，在生物體或非生物體如導尿管等表面形成生物被膜的能力，使鮑曼不動桿菌能夠耐受干燥﹑缺乏營養及消毒滅菌劑等惡劣環境壓力，逃避宿主的免疫保護反應，可引起尿路感染，繼發性腦膜炎，傷口和燒傷感染以及肺炎[11]。目前，中藥對于鮑曼不動桿菌生物膜形成與耐藥性之間的關系的報道鮮見，對于分子機制的研究仍存在爭議。為進一步明確機制，本實驗選取廣東省第二中醫院CRAB菌株進行用藥前后藥敏反應檢測及耐藥基因檢測。

圖2 arm基因擴增產物電泳圖像

圖3 sul基因擴增產物電泳圖像

實驗結果顯示，在擴增的18對耐藥基因中，原菌液檢出floR基因，未檢出arm基因﹑sul基因，藥物作用后，五味子﹑烏梅﹑連翹實驗菌液都檢出floR基因﹑arm基因﹑sul基因，黃連﹑黃芩都檢出了floR基因及sul基因，部分菌株未檢出arm基因。用藥前后的藥敏實驗結果顯示：復方新諾明﹑替加環素有不同程度改變，主要為生物膜陽性菌株復方新諾明的藥敏濃度增高，生物膜陰性菌株復方新諾明的藥敏濃度降低;生物膜陽性菌株替加環素的藥敏濃度減低，生物膜陰性菌株替加環素的藥敏濃度升高， 耐藥基因檢測也顯示對應磺胺類藥物﹑四環素藥物耐藥機制sul基因和floR基因較原菌的結果有改變。arm基因對細菌的作用是通過甲基化細菌16SrRNA中A位點的特定核苷酸，使氨基糖苷類藥物不能與之結合，從而產生耐藥，這是一種由質粒介導的耐藥機制，而sul的耐藥機制是通過提高低親和力的二氫葉酸合成酶表達，使細菌通過產生這種酶的量增加以獲得耐藥性，該基因還可隨著質粒﹑轉座子及整合子/基因盒系統等元件擴散[12]; 藥敏結果與基因檢測結果一致，說明這五種中藥顆粒劑可能對細菌內葉酸合成途徑以及細菌蛋白質形成產生影響，導致藥敏結果的改變。

李慧玉等人通過研究黃連的有效成分小劈堿對大腸桿菌轉錄抑制作用的研究發現[13]， 小劈堿通過上游調控元件uPelement的TATA堿基序列抑制sulA﹑recA﹑16S的表達，從而發現TATA序列是小劈堿的作用靶點。司徒瑞儒等[14]人通過研究蛋白質組學研究，發現本研究小檗堿能夠上調外膜蛋白Ⅱ﹑AmpC﹑β-內酰胺酶﹑轉座酶等蛋白表達，減低硫醇過氧化物酶等蛋白表達，而本研究中五種中藥顆粒劑作用相似，可能與作用靶點相近﹑蛋白表達有關。也有文獻研究報道[15]，中藥抑菌作用的發生，主要通過細胞膜以及細胞壁的破壞起作用，本實驗中，用藥前后細菌藥敏改變不明顯，可能與中藥抑菌﹑抑制生物膜的機制差異有關。

細菌生物膜是細菌及其分泌物的胞外多聚糖等物質所形成的膜狀細菌群體，其生物抗性跟多種因素相關，有研究顯示[16]，從細菌附著到非生物表面的機理的原子分辨率見解，研究在體外聚乙烯等模型中，菌毛的表達導致重組菌株親水性的改變能夠有效減少病原體傳播，從而達到抑膜的效果。有研究顯示[17-20]，高濃度的鹽水﹑麥芽糊精﹑聚乙二醇等高滲濃度的低質量滲透性化合物與低質量親水性抗生素相結合，通過比較未處理和處理過的生物膜中可回收細菌的數量來評估效果，發現能夠有效抑制鮑曼不動桿菌生物膜。中藥顆粒劑懸液屬于高滲濃度化合物范圍，其產生抑膜作用可能與上述物質的原理相似。

基于以上結果，下一步我們將用藥前菌液細菌基因測序，擬通過檢測16S的功能區段，研究用藥前后生物膜形成相關基因表達的差異，以進一步探索黃連等五種中藥顆粒劑對CRAB的抑膜機制以及產生耐藥基因變化原因。另一方面，高滲濃度的低質量滲透性化合物與低質量親水性抗生素相結合能夠更好的產生抑膜效果出發，我們將探討實驗合適中藥與抗生素聯合抑膜實驗的研究。