沉默長鏈非編碼RNA FAM83H-AS1提高肺腺癌細胞的化學治療敏感性

郭家辰，徐然

（中國醫科大學附屬盛京醫院 1.檢驗科；2.胸外科，沈陽 110004）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發病率和致死率均居首位。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD） 的發病率呈明顯上升趨勢，在許多國家已超過鱗狀細胞癌成為最常見的肺癌組織學類型［1］。手術切除配合放射化學治療是目前治療LUAD的主要手段。中華醫學會肺癌臨床診療指南對LUAD的一線治療方案之一為培美曲塞和鉑類藥物（如順鉑） 的聯合治療。化學治療（簡稱化療） 能明顯改善LUAD患者的預后，但化療耐藥嚴重限制了化療的臨床應用。因此，研究并發現提高LUAD化療敏感性的方法非常重要。

近年來，許多非編碼RNA，特別是長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA） 被證明參與了包括LUAD在內的幾乎所有類型腫瘤化療耐藥的發生和維持［2-3］。FAM83H-AS1基因位于8q24.3，由于缺乏蛋白質編碼能力，屬于lncRNA。目前，已有多篇文獻［4-5］報道FAM83H-AS1在胃癌、前列腺癌等腫瘤中的存在表達和功能異常。WANG等［6］報道FAM83HAS1高表達與LUAD患者預后不良相關，且能夠促進LUAD的惡性進展并抑制細胞凋亡。然而，FAM83HAS1在LUAD化療耐藥中的作用尚不清楚。

本研究發現FAM83H-AS1與LUAD化療（培美曲塞和順鉑） 耐藥相關，能通過調控多藥耐藥相關基因ATP結合盒亞家族C成員1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1） 促進LUAD化療耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：104例LUAD及相應的正常肺組織（normal lung tissue，NLT） 標本均經支氣管鏡活檢或經皮肺活檢獲得，并由2名病理學家診斷為LUAD。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書。本研究包括男37例，女67例，年齡35～79歲，中位年齡為62.9歲。納入標準：所有患者均確診為LUAD，在確診前未接受治療。排除標準：患者病例信息不完整，或患有其他疾病。

確診后，57例LUAD患者選擇新輔助化療或姑息化療（培美曲塞和順鉑）。化療2～3個療程后復查胸部增強CT及血清腫瘤標志物。根據病灶大小及血清腫瘤標志物水平的變化，將患者分為敏感組（39例） 和不敏感組（18例）。

人肺動脈內皮細胞（pulmonary artery endothelial cells，PAEC） 購自武漢云克隆公司，肺腺癌細胞系（PC9和A549） 購自寧波明舟公司；多藥耐藥細胞系A549/CR為本課題組前期構建［7］。

1.1.2 主要試劑：培美曲塞和順鉑購自美國Sigmaaldrich公司；SYBR RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol和Lipofectamine 3000購自美國賽默飛公司；FAM83H-AS1抑制劑（sh-FAM83H-AS1） 及陰性對照（sh-NC） 購自廣州銳博公司；CCK8試劑盒購自上海碧云天公司；ABCC1和GAPDH抗體購自武漢云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR：TRIzol法從組織或細胞標本中提取總RNA，檢測RNA的純度和完整性。應用一步法SYBR RT-PCR試劑盒擴增FAM83H-AS1基因，按照說明書設定反應條件。引物序列見表1。反應體系和反應條件參照說明書。根據內參基因GAPDH的表達進行歸一化后，應用比較Ct值法計算FAM83H-AS1的相對表達量，并基于相對表達量的平均值，將所有LUAD患者分為高表達組和低表達組。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細胞培養及轉染：所有細胞系均應用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于5% CO2，37 ℃的條件下培養。將5×104個A549/CR細胞接種于6孔板中，培養24 h。按照說明書，應用Lipofectamine 3000將FAM83H-AS1抑制劑轉染入A549/CR細胞，培養5～6 h，更換培養基后繼續常規培養。

1.2.3 藥物敏感性檢測：分別用培美曲塞（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL）和順鉑（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和75 μg/mL） 處理A549/CR細胞。然后，按照說明書使用CCK8試劑盒檢測細胞活力。酶標儀檢測每個樣本的吸光度（450 nm），并計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 Western blotting：提取A549/CR細胞總蛋白，進行蛋白定量分析。取樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，4 ℃過夜封閉，與一抗（ABCC1抗體） 雜交，二抗孵育，化學發光，凝膠成像儀獲取圖像。利用Image J軟件對圖像中的條帶進行分析。

1.3 統計學分析

采用Graphpad prism 5軟件分析數據。每組實驗重復5次，數據以±s表示。差異比較采用單因素方差分析、t檢驗和χ2檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAM83H-AS1在LUAD中高表達

與NLT組織相比，LUAD組織中FAM83H-AS1的相對表達量顯著上調（圖1A，P＜ 0.001）。與PAEC細胞相比，在PC9和A549細胞中FAM83H-AS1的相對表達量明顯增加（圖1B，P＜ 0.001）。

LUAD組織中FAM83H-AS1的表達與患者的吸煙史和化療（培美曲塞和順鉑） 不敏感相關（P＜ 0.05），與年齡、性別和TNM分期無相關性（P＞ 0.05）。見表2。基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫的預后分析結果顯示，與FAM83H-AS1低表達的LUAD患者相比，FAM83H-AS1高表達的LUAD患者的生存時間更短，預后更差（圖1C，P＜ 0.05）。

表2 104例LUAD患者的FAM83H-AS1表達與臨床病理信息的相關性Tab.2 Correlation between FAM83H-AS1 expression and clinical pathological characteristics of 104 LUAD patients

圖1 FAM83H-AS1在LUAD中高表達Fig.1 High expression of FAM83H-AS1 in LUAD

2.2 FAM83H-AS1高表達與LUAD化療不敏感相關

與化療敏感組LUAD組織相比，不敏感組LUAD組織中FAM83H-AS1的表達顯著增加（圖2A，P＜0.05）。如圖2B和2C所示，A549細胞對培美曲塞和順鉑的IC50分別為（2.17±0.58） μg/mL和（10.86±1.97）μg/mL，而A549/CR細胞對培美曲塞和順鉑的IC50分別 為（13.48±1.37） μg/mL和（48.72±3.85） μg/mL。A549/CR細胞對培美曲塞和順鉑的耐藥系數分別為6.21和4.49，其表現出對培美曲塞和順鉑較強的耐受性。而且，與A549細胞相比，A549/CR細胞中FAM83H-AS1的表達顯著上調（圖2D，P＜ 0.05）。

圖2 FAM83H-AS1高表達與LUAD患者的化療不敏感相關Fig.2 High-expression of FAM83H-AS1 is related with insensitivity to chemotherapy in LUAD

2.3 沉默FAM83H-AS1提高A549/CR細胞對培美曲塞和順鉑的敏感性

實時定量PCR檢測證實轉染sh-FAM83H-AS1能夠顯著降低A549/CR細胞中FAM83H-AS1的表達（圖3A，P＜ 0.05）。與對照組相比，FAM83H-AS1沉默將A549/CR細胞對培美曲塞的IC50由（14.13±1.33） μg/mL降為（6.71±0.75） μg/mL（圖3B，P＜ 0.05），將對順鉑的IC50由（48.21±4.27） μg/mL降為（20.16±2.57） μg/mL（圖3C，P＜ 0.05）。沉默FAM83H-AS1提高了A549/CR細胞對培美曲塞和順鉑的敏感性。

圖3 沉默FAM83H-AS1提高A549/CR細胞對培美曲塞和順鉑的敏感性Fig.3 Silencing of FAM83H-AS1 enhances pemetrexed and cisplatin sensitivity of A549/CR cells

2.4 沉默FAM83H-AS1降低A549/CR細胞中的ABCC1蛋白的表達水平

基于TCGA的數據庫，應用生物信息學軟件GEPIA2進行基因表達相關性分析。結果顯示，FAM83HAS1與ABCC1基因的表達在LUAD中呈正相關（圖4A，P＜ 0.01）。而且，沉默FAM83H-AS1能夠抑制A549/CR細胞中ABCC1蛋白的表達（圖4B，P＜ 0.05）。

圖4 沉默FAM83H-AS1降低A549/CR細胞中的ABCC1蛋白的表達水平Fig.4 Silencing of FAM83H-AS1 decreases ABCC1 protein expression level in A549/CR cells

3 討論

近年來，諸多腫瘤學研究證實非編碼RNA參與了包括LUAD在內的多種腫瘤化療耐藥的發生和維持。尤其是lncRNAs，因其數量眾多、功能和機制復雜等特點，引起研究者的廣泛關注。例如，SLCO4A1-AS1通 過miR-4701-5p/NFE2L1途徑激活WNT通路，促進LUAD細胞的生長并誘導其對順鉑的耐藥［8］；LINC00485作為分子海綿結合microRNA-195調節其靶基因CHEK1，進而降低LUAD細胞對順鉑的化療敏感性［9］。

本研究結果顯示，FAM83H-AS1在LUAD中高表達。FAM83H-AS1的異常高表達與LUAD患者吸煙史及化療不敏感有關，而且其高表達與LUAD患者的不良預后相關。這些提示FAM83H-AS1參與了LUAD的化療耐藥，可能發揮癌基因的作用。

本研究還發現FAM83H-AS1在化療（培美曲塞和順鉑） 不敏感的LUAD組織和細胞系中高表達，而且FAM83H-AS1的沉默顯著提升了化療耐藥細胞株A549/CR對培美曲塞和順鉑的敏感性。進一步證明了FAM83H-AS1參與了LUAD的化療耐藥。

生物信息學分析結果顯示，LUAD中FAM83HAS1與ABCC1基因的表達正相關。而且，沉默FAM83H-AS1能夠抑制A549/CR細胞中ABCC1蛋白的表達。ABCC1是一個經典的多藥耐藥相關基因，屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族。ABCC1蛋白介導物質進出細胞，能在化療藥物起效前將其排出細胞外。諸多研究［10-11］證實ABCC1參與了幾乎所有惡性腫瘤的化療耐藥的發生，包括LUAD。據此，本研究認為FAM83H-AS1能夠通過正性調節ABCC1基因，促進化療藥物從細胞中排出，導致LUAD化療耐藥的發生。

綜上，FAM83H-AS1在LUAD中高表達，且與LUAD患者的化療不敏感相關，FAM83H-AS1能通過正性調節ABCC1基因，參與LUAD化療耐藥的形成。本研究有助于明確LUAD化療耐藥發生的分子機制，亦能夠為LUAD的臨床綜合治療提供新靶點。