花姜酮對急性肝損傷大鼠Nrf2/HO-1/NQO-1氧化應(yīng)激損傷的影響

石洪林 余文勝

肝臟是人體重要的新陳代謝及排毒臟器，其主要通過肝酶對進(jìn)入人體的藥物、酒精、蛋白質(zhì)、脂肪等外源性物質(zhì)進(jìn)行氧化還原、水解催化等生化反應(yīng)[1]。由于肝臟所負(fù)責(zé)的代謝功能較多，病毒感染、過量脂肪堆積、藥物濫用、酒精過量等原因易造成肝臟生理功能及生理結(jié)構(gòu)的損傷，也是肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的重要促發(fā)因素。肝臟損傷的發(fā)生和發(fā)展與其組織中線粒體結(jié)構(gòu)被破壞、線粒體呼吸鏈活性被抑制、活性氧（ROS）異常堆積增多，從而加劇氧化應(yīng)激損傷有著密切的關(guān)系[2-3]。花姜酮是姜科姜屬植物紅球姜[Zingiberzerumbet（L.）Smith]根莖中的倍半萜化合物，具有消腫鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗帕金斯、抗肝損傷等藥理活性[4-5]。雖然近年來關(guān)于花姜酮對急性肝損傷的作用有了初步研究，但未深入闡明其具體的作用機(jī)制[6]。本研究通過四氯化碳誘導(dǎo)建立急性肝損傷大鼠模型，深入研究花姜酮對急性肝損傷小鼠的作用及其可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用花姜酮治療肝損傷提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材 料

1.1動物 SD 大鼠50 只，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（浙）2018-0016，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，12h光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)開始前大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。該實(shí)驗(yàn)屬于前期課題申請的基礎(chǔ)研究，完全遵照動物實(shí)驗(yàn)的倫理要求進(jìn)行。

1.2藥物 花姜酮：美國Sigma 有限公司，批號B 201541；聯(lián)苯雙酯滴丸：北京協(xié)和藥廠，批號20201206。

1.3試劑 四氯化碳（分析純）：成都市科隆化工試劑廠，批號20 191122；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、羥自由基（·OH）、活性氧（ROS）、三磷酸腺苷（ATP）、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ（ComplexⅠ、Ⅲ）試劑盒：南京建成，批號20210504、20210507、20210513、20210523、20210527、20210514、20210612、20 210608；錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒：晶美生物工程有限公司，批號20210613、20 210604；兔抗小鼠核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf-2）、醌氧化還原酶-1（NQO-1）、血紅素加氧酶1（HO-1）多克隆抗體：美國Cell Signaling Technology 公司，批號21354、21476、21427；actin 多克隆抗體（中國Proteintech 公司，批號10586-BH）。

1.4主要儀器 UVmini-1240 型紫外-可見分光光度計(jì)（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；TGL-16G 高速臺式冷凍離心機(jī)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生設(shè)備有限公司）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備（美國BIO-RAD 公司）。

2 方 法

2.1動物分組及給藥 使用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只SD 大鼠分為五組：空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組（40mg/kg）、花姜酮低劑量組（5mg/kg）、花姜酮高劑量組（10mg/kg），每組10 只。腹腔注射相對應(yīng)藥物，每天1 次，每次注射0.8mL，連續(xù)注射5d。空白組、模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2急性肝損傷模型建立[7]末次注射給藥2h 后，模型組、聯(lián)苯雙酯組及花姜酮低、高劑量組腹腔注射0.2%四氯化碳花生油溶液（0.01mL/g），建立急性肝損傷大鼠模型。空白組予等體積花生油腹腔注射。

2.3生化指標(biāo)檢測 注射四氯化碳花生油溶液后16h 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠腹主動脈取血，3500r/min 高速低溫離心機(jī)分離10min，吸取上清液。按試劑盒說明書操作，采用ELISA 法檢測大鼠肝功能指標(biāo)AST、ALT 及抗氧化指標(biāo)Mn-SOD、CAT、ComplexⅠ、Ⅲ活性、氧化因子MDA、·OH、ROS、ATP含量。

2.4Western blot 法檢測 Western blot 法檢測肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)水平。冰浴下制備肝臟10%的勻漿液，12 000r/min，有效離心半徑8cm，4℃，高速離心5min，分離上清液。用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，根據(jù)目的蛋白分子量的大小采用不同濃度的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。將配置好的SDS-PAGE 膠置于電泳槽中，待用蛋白置于水鍋中煮沸5min 后，混勻，上樣孔中分別加入Marker 及樣品蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，洗膜，加入相對應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，TBST 溶液洗膜，加入稀釋的二抗，水平搖床中孵育60min，TBST 溶液洗膜，暗室中曝光顯影。凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析蛋白條帶。

2.5病理學(xué)檢測 切除部分肝臟，制作石蠟，將其切片在二甲苯中脫蠟，移入二甲苯與純乙醇（1∶1）的混合液中，乙醇逐級脫水，蘇木精染液染色，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸乙醇分色，蒸餾流水沖洗，0.5%伊紅染液染色，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察肝組織病變程度。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H 秩和檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠血清ALT、AST 水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠血清ALT、AST 含量均有所下降（P＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ALT 含量較高，AST 含量較低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯(lián)苯雙酯組為肝損傷模型大鼠，予3.75mg/kg 聯(lián)苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠，予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠，予5g/kg 花姜酮混懸液；ALT為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.2各組大鼠肝組織病理學(xué)結(jié)果比較 HE 染色結(jié)果顯示，空白組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)清晰且大小形態(tài)均一，排列整齊呈放射狀；模型組大鼠肝臟細(xì)胞大小不一，且呈不規(guī)律排列順序，有大面積空泡變性及出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死；聯(lián)苯雙酯組肝組織細(xì)胞排列較模型組整齊且規(guī)律，細(xì)胞形態(tài)較好，空白變性較少，炎癥細(xì)胞浸潤減少；花姜酮高劑量組肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，排序基本呈放射狀排列，空泡數(shù)量及炎癥浸潤細(xì)胞較少；花姜酮低劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，細(xì)胞形狀及大小不一，排列混亂，較模型組整齊，空泡數(shù)量及炎癥浸潤細(xì)胞較多。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)結(jié)果（HE 染色×400）

3.3各組大鼠肝組織Mn-SOD、CAT 活性及MDA含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織Mn-SOD、CAT 活性降低，MDA 含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織Mn-SOD、CAT 的活性增加，MDA 含量減少（P＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組CAT 活性較高、MDA 含量較多（P＜0.05），Mn-SOD 活性無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織氧化因子Mn-SOD、CAT 活性及MDA 含量比較（）

表2 各組大鼠肝組織氧化因子Mn-SOD、CAT 活性及MDA 含量比較（）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯(lián)苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯(lián)苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；Mn-SOD為錳-超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；MDA 為丙二醛；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.4各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織·OH、ROS 含量明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織·OH、ROS 含量顯著降低（P＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ROS、·OH 含量較低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較（nmol/mg，）

表3 各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較（nmol/mg，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯(lián)苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯(lián)苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；ROS 為活性氧；·OH 為羥自由基；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.5各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織ComplexⅠ、Ⅲ活性降低，ATP 含量減少（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織ComplexⅠ、Ⅲ活性提高ATP 含量增加（P＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ComplexⅠ、Ⅲ活性及ATP 含量較高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較（）

表4 各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較（）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯(lián)苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯(lián)苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；ComplexⅠ為線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ；ComplexⅢ為線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ；ATP 為三磷酸腺苷；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.6各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)較高（P＜0.05）。見表5，圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)比較

表5 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)比較（相對表達(dá)量，）

表5 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)比較（相對表達(dá)量，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯(lián)苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯(lián)苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；Nrf-2 為核因子E2 相關(guān)因子2；NQO-1 為醌氧化還原酶-1；HO-1 為血紅素加氧酶1；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯(lián)苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

4 討論

肝細(xì)胞對ROS 生成能力遠(yuǎn)高于清除能力，引起產(chǎn)生與清除之間不平衡，而造成的肝臟氧化應(yīng)激損傷在肝臟疾病的病理進(jìn)程中起重要作用[8]。線粒體在正常呼吸過程中，會有一小部分氧氣不能完成傳輸電子，而形成具有細(xì)胞毒性的氧自由基。正常情況下，肝臟可通過酶系統(tǒng)和小分子抗氧化劑的抗氧化防御系統(tǒng)對所產(chǎn)生的氧自由基通過氧化還原平衡進(jìn)行消除[9-10]。但當(dāng)肝臟功能受損或障礙時(shí)，線粒體呼吸過程所產(chǎn)生的氧自由基會與具有完整電子分子的氧原子上的電子進(jìn)行配對，使其成為新的氧自由基。同時(shí)肝臟對ROS 消除能力下降，細(xì)胞內(nèi)大量的ROS 產(chǎn)生及堆積，對DNA 堿基反應(yīng)進(jìn)行破壞，并促使生物膜發(fā)生脂質(zhì)氧化，進(jìn)而形成氧化應(yīng)激，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的凋亡聯(lián)級反應(yīng)，引起肝細(xì)胞損傷及凋亡[11]。

Nrf-2 是重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，其與改善氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷有著重要的關(guān)系[12]。研究表明，在病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化等急慢性肝損傷中Nrf-2 是治療的關(guān)鍵調(diào)控因子[13-14]。Nrf-2 可通過環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）依賴途徑和非依賴途徑被激活，使其由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與特定的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合后，激活下游Mn-SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力，增加機(jī)體對氧化自由基ROS、·OH 的清除效率，減少氧化應(yīng)激對線粒體的損傷，進(jìn)而改善線粒體的呼吸效能[15-16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花姜酮能提高肝臟中CAT、Mn-SOD 的活性及ATP 含量，降低·OH、ROS、MDA 的含量，同時(shí)增加肝臟中ComplexⅠ、Ⅲ活性，提示花姜酮能提高機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)功能，減緩氧化應(yīng)激損傷。

HO-1、NQO-1 是Nrf-2 下游的Ⅱ相解毒酶。在氧化應(yīng)激損傷過程中，HO-1、NQO-1 可催化血紅蛋白降解產(chǎn)生膽綠素和CO 等產(chǎn)物，減少脂質(zhì)過氧化含量，發(fā)揮抗氧化、抗炎的作用。同時(shí)HO-1、NQO-1 也可防止細(xì)胞凋亡，降低肝臟損傷相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，是抗氧化中重要的防御分子。故Nrf2/HO-1/NQO-1 信號通路是減少氧化應(yīng)激對肝臟損傷的有效途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花姜酮能增加肝臟中Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)。

綜上所述，花姜酮能改善急性肝損傷大鼠肝功能、增加抗氧化因子CAT、Mn-SOD 的活性及ATP 含量，增強(qiáng)對ROS、·OH、MDA 的清除能力，提高肝臟中ComplexⅠ、Ⅲ活性及Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達(dá)，減緩氧化應(yīng)激對肝臟的損傷，達(dá)到對急性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與花姜酮調(diào)控Nrf2/HO-1/NQO-1 信號通路有著密切的關(guān)系。