LncRNA XIST靶向miR-511-3p調控食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

陳堅 肖宗位 高珂 李源 劉先 王曉瑋 李陽 毛龍

食管癌是臨床上常見的消化系統腫瘤，全球確診患者80%來自發展中國家，而且男性患者的發病率是女性的3倍[1]。雖然食管癌患者在治療上有所改善，但是5年的總生存率和5年手術切除食管的患者生存率(15%～40%)依然很差[2]。2015年中國患有食管癌高達24.5萬例，其發病率和死亡率已經高于全球的平均水平[3,4]。長鏈非編碼RNA在多種腫瘤疾病的發生發展中已經取得了明顯的作用效果，可以調節下游miRNA的表達發揮腫瘤促進或抑制的作用，為食管癌的治療和預后提供新的證據[5]。Wu等[6]研究顯示，XIST在食管鱗狀癌組織和食管癌細胞中表達上調，與不良預后顯著相關；XIST通過miR-101/EZH2調節食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-511-3p前列腺癌組織和癌細胞中表達下調，與癌癥分期和較短的總生存率顯著有關，miR-511-3p通過下調AKT3抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]，但是在食管癌細胞中研究機制尚不明確。本研究探討XIST通過靶向miR-511-3p表達對食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為食管癌的臨床研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 正常食管黏膜上皮細胞Het-1A和食管癌細胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150均購自中國科學院上海細胞庫；Lipofectin 2000試劑盒、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI 1640培養基均購自美國Gibco公司；si-NC、si-XIST、miR-NC、miR-511-3p、anti-miR-NC和anti-miR-511-3p均購自上海吉瑪公司；Prime Scrip試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自大連Ta Ka Ra公司；引物購自上海生工公司；MTT試劑盒購自碧云天公司；Transwell小室、Matrigel基質膠均購自美國Corning公司；PCNA抗體、MMP-抗體2和GAPDH抗體均購自美國abcam公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養與轉染 將冷凍的正常食管黏膜上皮細胞Het-1A和食管癌細胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150復蘇后，在5% CO2飽和濕度、溫度為37℃的恒溫培養箱內進孵育，細胞均在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基內進行培養。細胞密度生長至85%，加入胰蛋白酶消化培養。取對數生長期的食管癌細胞Eca109，接種至6孔板內，將細胞分組，分別為：si-NC組(轉染si-NC)、si-XIST組(轉染si-NC)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-511-3p組(轉染miR-511-3p)、si-XIST+anti-miR-NC組(共轉染si-XIST和anti-miR-NC)和si-XIST+anti-miR-511-3p組(共轉染si-XIST和anti-miR-511-3p)。食管癌細胞Eca109轉染時嚴格參照Lipofectin 2000試劑盒說明書。

1.3 qRT-PCR檢測XIST和miR-511-3p的表達 采用TRIzol試劑盒說明書提取食管癌細胞Eca109中的總RNA，然后將總RNA進行反轉錄合成cDNA模板，步驟參照Prime Scrip試劑盒說明書。最后采取SYBR Premix Ex Taq試劑盒的說明書配置反應體系進行PCR擴增，分別以β-actin和U6作為內參，按照公式2-ΔΔCt計算XIST和miR-511-3p的表達量。

1.4 MTT檢測細胞的增殖 收集對數生長期的食管癌細胞Eca109接種至96孔板內，密度為1×103個/孔鋪在孔板內。置入恒溫培養箱內繼續培養24 h、48 h、72 h時，每孔按照20 μl加入MTT溶液，遮光繼續反應4 h后，加入100 μl DMSO試劑，在搖床上震蕩快速混勻后，酶標儀490 nm處檢測96孔板內的光度值。

1.5 Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲 細胞遷移實驗：收集對數生長期的食管癌細胞Eca109，消化后接種至24孔板內(密度為2×105個/ml)，取出200 μl添加在Transwell小室上室內，下室添加600 μl的含有胎牛血清的RPMI 1640培養基培養液，隨后置于恒溫培養箱內繼續培養24 h。倒去培養基，采用多聚甲醇固定15 min，再采用結晶紫染色15 min，擦去小室內層的細胞，沖洗，在顯微鏡下觀察細胞遷移數目。細胞侵襲實驗：將Matrigel基質膠解凍后，按照5∶1(不含血清培養RPMI 1640培養基：Matrigel基質膠)稀釋，取出50 μl鋪于Transwell小室上室內，培養6 h，其余步驟同上述細胞遷移實驗一致。

1.6 Western blot檢測PCNA和MMP-2的蛋白表達 收集對數生長期的食管癌細胞Eca109加入蛋白裂解液，混勻后，提取總蛋白，采用BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，取35 μg上樣蛋白在凝膠電泳處理，將處理后的蛋白轉移至PVDF膜。PVDF膜內采用5%脫脂奶粉封閉培養2 h，加入一抗蛋白4℃過夜孵育，PBST清洗后，加入二抗室溫下孵育，PBST清洗后加入電化學發光液，顯影。采用ImageLab 6.0.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的表達。

1.7 雙熒光素酶報告實驗驗證XIST和miR-511-3p的關系 通過在線軟件Starbase預測XIST和miR-511-3p互補的核苷酸序列，構建雙熒光素酶報告載體XIST-wt和XIST-mut，參照Lipofectin 2000試劑盒的說明書與miR-NC或miR-511-3p轉染至食管癌細胞Eca109內，繼續培養48 h，通過雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 XIST和miR-511-3p在食管癌細胞中表達 與正常食管黏膜上皮細胞Het-1A相比，食管癌細胞EC9706、Eca109、TE-1、KYSE150中XIST表達均顯著增加(P<0.05)，miR-511-3p表達均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 XIST和miR-511-3p在食管癌細胞中表達

2.2 干擾XIST對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-XIST組的XIST表達、OD值(48 h、72 h)、遷移細胞數目、侵襲細胞數目、PCNA和MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 干擾XIST對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 過表達miR-511-3p對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-511-3p組的miR-511-3p表達顯著增加，OD值(48 h、72 h)、遷移細胞數目、侵襲細胞數目、PCNA和MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 過表達miR-511-3p對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 XIST靶向miR-511-3pp表達 XIST和miR-511-3p存在互補的核苷酸序列，與miR-NC組比較，miR-511-3p組XIST-wt熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-XIST組XIST表達顯著降低(P<0.05)，miR-511-3p表達顯著增加(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 XIST和miR-511-3p存在互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 XIST靶向miR-511-3p的表達

2.5 抑制miR-511-3p可以逆轉干擾XIST對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響 與si-XIST+anti-miR-NC組比較，si-XIST+anti-miR-511-3p組的miR-511-3p表達顯著降低，OD值(48 h、72 h)、遷移細胞數目、侵襲細胞數目、PCNA和MMP-2蛋白表達顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 抑制miR-511-3p可以逆轉干擾XIST對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

長鏈非編碼RNA-X染色體失活特異轉錄物(lncRNA XIST)在多種腫瘤(結直腸癌、胃癌、胰腺癌和食管癌等)中表達上調，與腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結轉移顯著相關[8,9]。XIST可以介導內源競爭RNA調控網絡參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為[10]。Liu等[11]研究，顯示XIST與miR-34a存在互補核苷酸序列，XIST通過負調控miR-34a的表達抑制甲狀腺癌的轉移。Zheng等[12]研究結果顯示，XIST通過調控miR-337/JAK2發揮在胃癌中作用。在胰腺癌的研究中結果顯示，XIST在轉移的胰腺癌組織中表達上調，XIST通過上調miR-429調節ZEB1表達促進胰腺癌的遷移、侵襲和EMT[13]。XIST還可以通過下調miR-212-3p/CBLL1軸抑制非小細胞肺癌的增殖、遷移、侵襲和EMT[14]。Chen等[15]研究顯示，XIST在食管癌組織和細胞中高表達，抑制XIST顯著抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，XIST通過激活JAK2/STAT3信號通路調控miR-494/CDK6發揮在食管癌中的致癌作用。本研究結果顯示，在正常食管黏膜上皮細胞比較，XIST在食管癌細胞高表達，干擾XIST可以顯著抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，與Chen等[15]研究結果一致，說明XIST可以作為食管癌的潛在生物標志物，發揮致癌的作用。

miRNA通過參與癌癥細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學過程調節腫瘤的進展[16]。miR-652-5p、miR-7-2-3p、miR-3925-3p和miR-219-3p被報道顯示與食管癌相關，其中miR-652-5p和miR-7-2-3p與總生存率顯著相關[17]。Han等[18]研究顯示，miR-485-5p在食管癌細胞中表達上調，抑制miR-485-5p可以明顯抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這與本研究結果相反。Zang等[19]研究結果顯示，過表達miR-124可以明顯抑制食管癌細胞的增殖和遷移，miR-124通過負調節NRP1表達參與食管癌的發生。Yin等[20]研究顯示，miR-133a-3p通過靶向負調控COL1A1抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其細胞凋亡。miR-511-3P在肺腺癌、結直腸癌和心血管疾病等有關[21-23]，但是miR-511-3p食管癌中尚無明確報道。本研究結果顯示，與正常食管黏膜上皮細胞比較，miR-511-3p在食管癌細胞低表達，過表達miR-511-3p可以顯著抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，雙熒光素酶實驗和qRT-PCR實驗證明了XIST可以靶向負調控miR-511-3p表達，抑制miR-511-3p可以逆轉干擾XIST對食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲的作用，這說明XIST通過下調miR-511-3p發揮在食管癌細胞中的作用。

綜上所述，干擾XIST可以明顯抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與上調miR-511-3p有關。