DEHP對斑馬魚仔魚HPG和HPA軸相關功能基因表達的影響

劉 飛，王 凡，鄭雅婷，李萌萌，冉娜娜，高曉楊，石亞男，朱娜娜，程惠敏，楊 瑞

(洛陽師范學院，河南洛陽 471934)

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一種鄰苯二甲酸型乙酰丙烯類的化學物質。因其成本低廉、可塑性較強、相容性高、兼容效果好等優點，被廣泛應用于醫用產品(醫療器材、一次性外科消毒手套等)、日常用品(玩具、雨衣等)中，來增強塑料制品的可塑性。DEHP通過范德瓦爾斯力或氫鍵與塑料分子形成不穩定的結構，因此，它容易通過清洗等方式進入空氣、水體或其他物質之中。在高溫制作或者燃燒塑料制品過程中，DEHP由于蒸汽壓低也可通過煙塵等方式釋放到環境之中。隨著我國對DEHP這類鄰苯二甲酸類化學物質重視程度加強，有關地表水中含有DEHP的研究被不斷報道出來。魚類處于水生捕食鏈中較高營養級，并且終生生活在水中，極易受到水中環境污染物的影響，因此，開展DEHP對魚類影響的研究是很有必要的。

斑馬魚()是一種與人類基因有著高度同源性，被廣泛應用于毒理學、病理學及藥理學研究中的理想模式生物。已有研究表明，DEHP對斑馬魚具有內分泌、免疫、遺傳、肝臟等毒性。然而在魚類整個生命周期中，一般認為魚的早期生命階段(從受精卵生長發育至仔魚階段)是對外在污染物的干擾作用的最敏感階段，主要是由于這一階段的魚為補償因污染物干擾作用而引發體內一系列生化反應的能力與成魚相比較弱。目前發現DEHP對斑馬魚這一生命階段影響的研究較少，僅發現DEHP可導致斑馬魚胚胎/仔魚發育畸形甚至死亡，干擾下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸從而致使甲狀腺激素升高。

DEHP與天然甲狀腺激素3,30,5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)的某些生理功能類似，其代謝產物結構與內源性雌激素具有一定的相似性，所以，DEHP對內分泌系統干擾的影響深受關注。研究環境污染物對魚類內分泌系統的影響，主要研究其對魚類三條主要內分泌軸[下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)、HPT軸]的影響。因此，本實驗開展DEHP斑馬魚胚胎/仔魚階段HPG軸和HPA軸的相關功能基因表達影響的研究，以期揭示其對斑馬魚內分泌干擾的分子機制。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚的繁殖

2月齡野生型斑馬魚經過本實驗室養殖到5月齡性成熟后進行繁殖。養殖期間，溫度保持在26～28 ℃，每天投喂3次新鮮孵化的豐年蟲。斑馬魚的繁殖過程如下：選擇健康成熟的雄性和腹部膨大的雌性斑馬魚作為親本，繁殖前一晚將雌雄親本按1∶1放置在斑馬魚繁殖交配盒(上海海圣生物實驗設備有限公司)中，并用隔板隔開，避光過夜。次日清晨開燈并將隔板抽去。40 min后，吸出交配盒中雜質，用魚卵撈網(上海海圣生物實驗設備有限公司)收集魚卵，放置于培養皿中，用海鹽水清洗胚胎，然后用體視顯微鏡觀察，剔除不正常的胚胎。將盛有胚胎的培養皿暴露于(27±1)℃的恒溫培養箱中進行胚胎暴露實驗。

1.2 斑馬魚的胚胎毒性實驗

實驗前，用丙酮作為助溶劑將DEHP配制成高濃度的母液。實驗中所用相應濃度的暴露液由高濃度母液經胚胎培養水稀釋而得，暴露液中的丙酮小于暴露液體積的0.01‰。DEHP暴露處理液的名義濃度依次為10、30和300 μg/L，對照組為0.01‰ 丙酮。使用150 mm的培養皿作為實驗的暴露容器，每個濃度設置5個生物學平行，每個培養皿加入50 mL暴露液，200枚發育正常的胚胎，然后再將其放在光照培養箱中進行暴露實驗，暴露實驗期間用一次性吸管及時吸出停止發育或者死亡的胚胎和仔魚。在胚胎受精后96 h，吸除培養皿中雜質，用專用魚苗撈網隨機撈取各培養皿中的仔魚50尾，吸干水分后，置于裝有RNA保存液(RNAlater)的EP管中，4 ℃過夜后再放置在-80 ℃冰箱中保存，以備后續實驗所用。

1.3 斑馬魚仔魚的總RNA抽提及逆轉錄

取出上述裝有斑馬魚仔魚樣品的EP管，待樣品解凍后，依據RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)上的步驟提取各樣品中的總RNA，抽提完成后測定各樣品的/值，結果顯示均在1.8～2.0之間，同時，用凝膠電泳分析顯示28 S的亮度和寬度是18 S的2倍左右，表明RNA質量較好。

按照反轉錄試劑盒(東洋紡反轉錄試劑盒)中的步驟將RNA反轉錄成cDNA，對于濃度不在100～250 ng/μL的RNA樣品，在反轉錄之前用DNase/RNase-free ddHO進行不同比例稀釋，然后用超微量分光光度計測定其濃度。反轉錄過程中，首先65 ℃預變性5 min，以提高后續反轉錄效率。將變性后的RNA樣品與5X RT Buffer、RT Enzyme Mix、Primer Mix和Nuclease-free Water配置成20 μL的反轉錄反應體系，混勻后放置于梯度PCR儀中進行反轉錄反應。

1.4 Real-Time PCR

斑馬魚β-actin(內參)、HPG軸和HPA軸的相關功能基因(19、2、3、-、-和-基因；、、2、、和基因)的引物序列來自于相關文獻報道，詳見表1。

表1 PCR所用基因的引物序列

根據實時熒光定量試劑盒(德國DBI生物科技公司)中操作步驟，將反轉錄后的cDNA樣本與相應基因上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix和無菌ddHO配成20 μL的RT-qPCR反應體系，混勻后，放到實時熒光定量PCR儀中對各基因進行擴增。

1.5 數據分析

采用2法對RT-qPCR反應后獲得的Cq值進行分析，運用Excel 2016分析計算各目的基因mRNA的相對表達量。然后再利用SPSS 13.0軟件進行One-Way ANOVA分析，并用最小顯著差數法(LSD法)分析對照組和處理組之間的差異。若<0.05，則表示差異顯著；<0.01，則表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 DEHP對斑馬魚早期發育階段HPG軸相關基因表達的影響

DEHP對斑馬魚早期生命階段生殖軸的相關功能基因(19、2、3、-、-和-基因)表達影響的RT-qPCR結果見圖1。與垂體相關的芳香化酶基因19、下丘腦相關的促性腺激素釋放激素基因3、垂體相關的雌激素受體基因-和-在DEHP質量濃度為30 μg/L時表達量顯著升高，依次升高了116%、191%、132%和267%；下丘腦相關的促性腺激素釋放激素基因2在各DEHP處理組表達量顯著升高，依次升高了82%，208%和91%。垂體中的卵泡刺激素基因-在各DEHP處理組表達量無顯著差異。以上結果表明，DEHP顯著升高了斑馬魚早期生命階段HPG軸的相關功能基因的表達。

圖1 DEHP對斑馬魚仔魚HPG軸的相關基因表達的影響(n=5)

2.2 DEHP對斑馬魚早期發育階段HPA軸相關基因表達的影響

DEHP對斑馬魚早期生命階段腎上腺軸的相關功能基因(、、2、、和基因)表達影響的RT-qPCR結果見2。HPA軸的相關功能基因(基因除外)在各DEHP處理組表達量顯著降低，其中，下丘腦和垂體相關的阿黑皮素原基因依次降低了68%、68%和55%，垂體中鹽皮質激素受體基因依次降低了75%、78%和57%，腎上腺中的黑素腎上腺皮質激素2受體基因2依次降低了46%、79%和55%，下丘腦中的促腎上腺皮質激素釋放激素基因依次降低了76%、82%和65%，垂體中的糖皮質激素受體基因依次降低了52%、54%和72%。垂體中的促腎上腺皮質激素釋放激素結合蛋白基因在各DEHP處理組表達量無顯著差異。以上結果表明，DEHP顯著降低了斑馬魚早期生命階段HPA軸的相關功能基因的表達。

圖2 DEHP對斑馬魚仔魚HPA軸的相關基因表達的影響(n=5)

3 討論

魚類生殖內分泌系統的調控主要就是通過魚類的HPG軸完成，主要過程為：首先由下丘腦依據機體生理功能的需要釋放不同類型的促性腺激素釋放激素(GnRHs)作用于魚類的垂體的相應部位上，后者通過合成并釋放促性腺激素(GTH)作用于性腺，進而有效調控魚類的生殖。魚類的促性腺激素依據功能的不同又可分為促黃體素(LH)和促卵泡激素(FSH)。19、-和-是生殖內分泌系統中性激素合成相關功能基因，主要是在性腺和腦中表達。由于DEHP代謝產物結構與內源性雌激素具有一定的相似性，因此，通過測定HPG軸的相關功能基因表達量可探討DEHP對斑馬魚早期生命階段生殖內分泌干擾的分子機制。

2和3是促性腺激素釋放激素家族中的重要成員，其中3僅魚類中發現。2和3對魚類生殖內分泌系統起重要作用，其靶器官為垂體，通過2和3的合成與釋放來調控垂體中FSH和LH的合成與釋放，進而抑制或促進性腺激素的合成與釋放。本研究中，DEHP處理組的2和3表達量上升，這可能會導致性激素的合成發生改變。19是芳香化酶，是細胞色素p450中的一種，在魚類生殖內分系統中主要作用是催化雄激素轉化為雌激素，在雌激素的合成中起到關鍵作用。在本研究中，與對照組相比，30 μg/LDEHP處理組19表達量顯著性升高，這可能會導致E2/11KT比例增加。ERs是與雌激素特異性結合的受體分子，二者的結合是雌激素生理作用發揮的前提，進而調控生物體生殖等生理過程。本研究中，-和-的表達量在30 μg/LDEHP處理組顯著性升高，進一步表明了DEHP能夠導致斑馬魚胚胎/仔魚E2/11KT比例增加。另有研究表明，HPG軸和HPT軸間存在著交互作用，賈盼盼的研究報道了DEHP增加了斑馬魚胚胎/仔魚HPT軸和TH濃度相關基因的表達。因此，DEHP也有可能通過HPT軸間接作用于HPG軸從而導致HPG軸的相關功能基因的表達。以上這些結果表明，DEHP不僅可以直接作用于斑馬魚胚胎/仔魚的HPG軸，也可間接作用于HPG軸，影響其相關功能基因的表達，從而干擾魚類的生殖內分泌系統。

HPA軸是神經內分泌系統的重要組成部分，下丘腦受到刺激會分泌促腎上腺皮質激素釋放激素(Crh)，Crh可以誘導垂體釋放促腎上腺皮質激素(Acth)，進而作用于腎上腺皮質合成糖皮質激素(主要是皮質醇)；Crh還可促使Acth的前體阿黑皮素原(Pomc)水解。Acth也可作用于黑素腎上腺皮質激素2受體(Mc2r)，加速腎上腺糖皮質激素的合成和分泌。促腎上腺皮質激素釋放激素結合蛋白(Crhbp)能夠與Crh結合使其失活，從而影響機體的內分泌。鹽皮質激素受體基因()和糖皮質激素受體基因()都屬于類醇激素受體,是HPA軸負反饋的主要調控者。目前，關于DEHP對斑馬魚HPA軸的影響的研究尚未被報道。本研究中，斑馬魚胚胎暴露于DEHP 4 d之后，、、、2和基因表達水平在DEHP處理組顯著降低，說明在DEHP的刺激下，斑馬魚下丘腦基因的表達量下降，其誘導垂體釋放的Acth下降，同時，的下降也促使Acth的前體Pomc水解，進而反饋于Pomc，使基因轉錄水平下降。另外，下降的Acth調節Mc2r的合成，致使2基因表達的降低，進而影響腎上腺糖皮質激素的合成和分泌。DEHP的刺激也抑制了斑馬魚和基因的表達量，下降的和也會負反饋調控HPA軸。有研究顯示，化學物質可以通過降低斑馬魚體內E2的濃度來降低皮質激素的濃度，而本研究的結果顯示DEHP可能會增加斑馬魚體內的E2的濃度，這表明DEHP對斑馬魚早期生命階段的HPA軸的影響并沒有通過對HPG軸的影響而間接作用于HPA軸，可能是通過直接作用于HPA軸而引起的。

4 結論

通過DEHP對斑馬魚的胚胎/仔魚階段的暴露實驗發現，DEHP導致HPG軸上相關基因顯著上調，HPA軸上相關基因顯著下調。這表明DEHP對斑馬魚胚胎/仔魚階段的2個主要內分泌分子通路的影響將會導致內分泌功能的改變，從而可能影響斑馬魚的后期生長發育。