包藥珠核對提高淡水有核珍珠育珠效果的初步研究

李曉紅，詹 毅，虞 立，金偉鋒

(1.浙江中醫藥大學，杭州 310053；2.安徽省新貝生態農業發展有限公司，浙江諸暨 311800)

三角帆蚌()是我國主要的淡水育珠蚌，廣泛地分布于安徽、浙江、江蘇和湖北等地。育珠蚌在進行插核手術后，傷口極易感染病菌，致使育珠蚌吐核甚至死亡，讓珍珠養殖戶遭受經濟損失。為了提高珍珠的產量和品質，很多研究者從育珠環境、外套膜細胞的培育、術前術后處理以及細胞小片的處理等方面對有核珍珠培育技術做了大量的研究和實踐工作。也有研究者對珠核的材質和固核技術進行探索和研究，李詠梅等將珠核用處理液浸泡后再植入育珠蚌體內，取得了很好的育珠效果。從現有的研究來看，尚未有研究者使用珠核表面包裹藥物，制成包藥珠核，將具有消炎抗菌、滋養育珠蚌的作用。

為了降低育珠蚌死亡率，很多養殖戶向水面潑灑抗生素或者投喂含有抗生素的餌料，以達到消炎抗菌的目的。長此以往，不僅污染了水體環境，也危害到人類的健康。因此，藥物配方和用藥方式對于提高珍珠的品質和保持生態環境尤為重要。由于中藥含有的多種有效成分具有抗菌消炎，增強機體的免疫能力的功能，可以有效解決耐藥性和藥物殘留的問題，目前已廣泛地應用于水產養殖。多項研究表明，中藥黃芪所含有的黃芪多糖能有效增強動物的非特異免疫活性，促進動物生長。黃霉素具有毒性低，不易與其他抗生素產生拮抗作用，安全性高等特點，是國家認定的動物“綠色”飼料添加劑。

近年來，很多學者將向后反饋神經網絡(back propagation neural network,BPNN)模型與遺傳算法(genetic algorithm,GA)的尋優功能相結合來研究中藥有效成分提取工藝條件優選的問題。由于在訓練模型的過程中追求擬合誤差的最小化，導致網絡中隱層神經元數目增多，使網絡模型出現過度擬合。同時，傳統BP神經網絡的權值往往會使算法陷入局部極值，導致網絡訓練失敗。而利用遺傳算法的全局尋優功能，優化神經網絡的結構，并利用全局尋優功能，找到全局最優解，更加符合包藥珠核各藥物濃度之間非線性的特征。本實驗對珠核包衣中黃芪藥液的適宜濃度、黃霉素和土霉素的藥液的適宜濃度進行測試，以育珠蚌死亡率、成珠率、優質珠率為指標，采用遺傳神經網絡算法，以期探索一種新型包藥珠核的生產工藝方法，優化包衣中各種藥物成分的配比提高淡水珍珠的品質。

1 材料與方法

1.1 材料

選取體質健康、體長100～130 mm的2齡三角帆蚌為育珠蚌，體長50～80 mm的1齡蚌制做細胞小片，均由浙江省諸暨山下湖珍珠養殖基地培育。

珠核由淡水麗蚌殼研磨而成，正球形，直徑2.5 mm，表面光滑，符合質量要求。制作包藥珠核的藥物[黃霉素(批號：11015-37-5)、土霉素(批號：031161018)和中藥材黃芪(批號：1731213)]均購自江山市萬里中藥材有限公司。

1.2 包藥珠核的制做

稱取3 600 g干燥的黃芪，切片后放入過濾袋，扎緊袋口并留有一定空余，放入裝中藥煎藥機玻璃桶，加入6 000 mL清水浸泡30 min。設置高火煎煮20 min，轉文火煎煮30 min，過濾，收集濾液，查看藥液體積，如不足1 800 mL，則在藥液中加入清水至1 800 mL，冷卻至常溫備用。取黃霉素18 g溶于180 mL清水，土霉素18 g溶于20 mL濃度95%的乙醇溶液。將配置好的三種藥液混合，則混合藥液中黃芪生藥濃度為1.8 g/mL，黃霉素的濃度為9 mg/mL，土霉素的濃度為9 mg/mL。類似的，可以配制正交實驗組其他方案所需的混合藥物。

將珠核放入注有清水的滾筒中滾動清洗三次，洗去表面粉塵，再放入超聲波清洗機中繼續清洗30 min，洗去殘余粉塵。清洗后的珠核放入沸水中煮40 min滅菌消毒，然后置于烘箱60 °C干燥。將處理好的珠核浸沒在不同濃度混合的藥液中，每隔10 min攪拌一次，常溫下浸泡30 min，取出，放于烘箱中烘干，即得包藥珠核。

1.3 外套膜插核手術

將育珠蚌刷洗干凈，放于清水池中10 h左右，讓母蚌排除體內污泥和糞便等。將蚌體固定在手術臺上，用開殼器緩慢將蚌殼撐開約10 mm，加塞。用開口針在外套膜后端靠近腹緣處開口，口徑與深度以能放入一個珠核和一個細胞小片為宜。從小片貝上切下用來做細胞小片的外套膜，滴上紅藥水進行殺菌，將外套膜去掉邊緣觸手，再切成長度約為0.8 mm的小片，用送針將干燥的珠核與黏在一起的細胞小片從開口處移植到育珠蚌體內，每只育珠蚌植核30顆，兩側各15顆。術后將育珠蚌吊養在育珠水塘，育珠期8個月，每個星期檢查一次，去除死蚌。

1.4 正交實驗設計

以黃芪生藥的濃度、黃霉素的濃度和土霉素的濃度為影響因素，以育珠蚌的成活率、留核率和優質珠率為指標，安排實驗。設一對照組，植入經消毒干燥處理過的無藥珠核，重復3組，每組用蚌100只。實驗組采用三因素四水平正交實驗設計方案，黃芪生藥的濃度分別為0.9、1.2、1.5、1.8 g/mL，混合藥液中黃霉素的濃度分別為6、7.5、9、10.5 mg/mL，土霉素的濃度分別為7.5、9、10.5、12 mg/mL。實驗組共16組，重復3組，每組用蚌100只。

1.5 數據的收集與處理

1.5.1 育珠蚌的成活率、留核率和優質珠率

育珠期結束后，分別統計對照組和實驗組育珠蚌存活的數量、留核數以及優質珍珠數，按下列方法計算各組成活率、留核率和優質珠率。

育珠蚌的成活率=100%×育珠期結束后活蚌的總數量/育珠蚌的總數；

留核率=100%×成活的育珠蚌留核總數/成活的育珠蚌植核總數；

優質珠率=100%×優質珍珠數/收獲珍珠的總數。

優質珠的衡量標準具有多樣性，聘請經驗豐富的珍珠養殖專家以及權威機構，對收獲的珍珠從光澤度、形狀、直徑、光潔度四個方面進行品質鑒定，選出優質珍珠。

1.5.2 基于熵權法的珍珠品質綜合評價指標的確定

熵權法是基于信息學的理論，通過計算指標的信息熵決定指標的權重的一種客觀賦權法。指標的變異性越大，所起的作用也越大，其權重也就越大。熵權法能夠消除信息之間的重疊性，深刻反映出指標信息熵值的效用價值，具有較高的可信度和精確度。本實驗先采用熵權法確定指標存活率、留核率和優質珠率的權重分別記為，，，再按照式(1)將它們進行線性加權合并為一個綜合評價指標。

=++

(1)

1.6 遺傳神經網絡優化模型的建立

利用實驗得到的統計數據，以神經網絡理論為基礎，利用遺傳算法優化隱層神經元的個數和網絡權值，建立藥用珠核生產工藝的遺傳神經網絡數學模型，再用遺傳算法的全局尋優功能，搜索最優生產工藝組合。

1.6.1 數據預處理

因實驗因素和實驗指標的量綱不同，因此在建立數學模型進行數據分析之前，先對數據按公式(2)進行歸一化處理，去除量綱和數量級對分析結果的影響，歸一化后的數據位均于[0,1]之間。

1.6.2 GA-BP神經網絡

BP神經網絡由輸入層、隱層和輸出層構成，具有簡單、計算量小等優點。但是，由于訓練開始時，系統中網絡權值、閾值、隱層神經元的個數等參數的設置具有隨機性，易導致訓練誤差增大或出現過擬合的現象。遺傳算法(Genetic Algorithm,GA)是一種基于自然選擇和種群遺傳機理的全局優化搜索算法。通過模擬種群個體在遺傳過程中的選擇、雜交和突變，實現適者生存，從而找到最佳個體。

GA-BP神經網絡先隨機生成一個初始權值種群，并對種群中的個體進行二進制編碼。然后，根據權值的適應度值，用GA算法對權值進行更新，淘汰劣的個體，留下優的個體再組合成新一代種群，不斷重復上面的過程，逐步得到最優解。GA-BP神經網絡算法可以有效地提高預測的精度和處理問題的速度，縮短網絡的訓練時間。基于遺傳神經網絡算法搜尋包藥珠核最佳生產工藝條件的具體方案如下：

將實驗數據歸一化處理，為了提高網絡的收斂性和泛化能力，采用留一交叉驗證方法，把所有正交實驗數據隨機分為訓練集和測試集；設置遺傳算法運行參數，利用遺傳算法優化BP神經網絡結構，根據個體適應度值，確定隱層神經元的個數；利用遺傳算法優化BP神經網絡各層之間的權值。根據網絡結構，對網絡的權值進行編碼，并生成初始種群。根據個體適應度值，不斷地運行選擇、交叉和變異算子，生成新種群，直至滿足標準，得到最優初始權值；再利用遺傳算法的全局尋優功能，對得到的BP神經網絡搜索最優解，得到制作包藥珠核各藥物的最優濃度組合。

利用Matlab14.0軟件對實驗結果進行計算和分析，按照熵權法的步驟，計算育珠蚌的死亡率、留核率、優質珠率的權重和綜合評價指標。設雙側顯著性檢驗<0.05，利用卡方獨立性檢驗，比較對照組和實驗組、重復組之間的死亡率、留核率和優質珠率是否有顯著性差異。借助Matlab14.0工具箱，設計遺傳神經網絡算法程序，以黃芪生藥濃度、黃霉素濃度、土霉素濃度為輸入，以綜合評價指標為輸出，搜索包藥珠核藥物的最佳濃度。

2 結果

2019年，于浙江省諸暨市山下湖珍珠養殖基地進行實驗，育珠期為3-11月，期間日平均氣溫約為12.7～29.8 ℃。11月底，剖蚌取珠，分別統計對照組和所有實驗組存活蚌的總數、留核總數和優質珠總數。植入無藥珠核的對照組育珠蚌存活率為(85.0±2.6)%，留核率為(70.3±2.9)%，優質珠率為(60.6±2.4)%。

2.1 正交試驗設計的方案和結果

以黃芪藥液濃度、黃霉素濃度和土霉素濃度為因素，設計三因素四水平正交試驗方案，各因素和水平見表1。

表1 正交試驗設計的因素和水平

熵權法確定、和分別是0.352 0，0.271 7，0.376 3，根據公式(2)計算珍珠品質的綜合評價指標。正交試驗設計的方案、結果和綜合評價指標值見表2。

表2 正交試驗方案及結果

經卡方檢驗，16個實驗組的育珠蚌存活率、留核率和優質珠率均明顯高于對照組，但3個重復組間無顯著性差異。

2.2 包藥珠核的最佳工藝條件的確定

以黃芪藥液濃度(g/mL)、黃霉素濃度(mg/mL)、土霉素濃度(mg/mL)為網絡輸入，以綜合評價指標為網絡輸出，建立GA-BP神經網絡模型，采用留一法將16組實驗數據分為測試集和驗證集，所有變量經過標準化處理。利用遺傳算法，對神經網絡進行訓練，確定隱層神經元個數和優化網絡權值，再對建立的神經網絡進行全局尋優，得到包藥珠核各藥物的的最佳濃度。

2.2.1 確定BP神經網絡結構

設定初始種群的大小為20，隱含層為1層，訓練的次數為20次，訓練的適應值為0.001。經過訓練，隱層神經元的數量與平均訓練誤差和平均預測誤差的關系如圖1所示。

圖1 神經元的數量與絕對誤差

從圖1可以看出，隨著隱層神經元數量的增加，雖然平均測試誤差不斷減小，但是當神經元數量為3時，平均驗證誤差最小，之后逐漸增大，出現過擬合現象，因此取隱層神經元的個數為3。以NMSE作為遺傳算法的適應度值，對神經網絡進行訓練，確定網絡權值和閾值，當訓練到15代時，訓練集與驗證集的最大絕對誤差為1.476，達到了預計值，擬合優度=0.86。訓練誤差和驗證誤差如圖2(a)所示，預測值與實際值的關系如圖2(b)所示。

圖2 GA-BP神經網絡訓練與預測結果.

2.2.2 最優生產工藝

基于上述建立好的GA-BP網絡模型，利用遺傳算法的全局尋優功能，實現對最優生產工藝組合的自主搜索，得到包藥珠核混合的最佳藥物濃度:黃芪生藥濃度為1.55 g/mL，黃霉素藥液濃度為7.9 mg/mL，土霉素藥液濃度為9.48 mg/mL，綜合評價指標可以達到94.49 %。

3 討論

3.1 包藥珠核規格對珍珠品質的影響

本實驗中所用到的珠核直徑均為2.5 mm，如果珠核的直徑變大，每只育珠蚌的植核數量將會減少，用于制作包藥珠核的最佳藥物濃度也會相應地發生改變。以6 mm直徑珠核為例，如果按本實驗中的最佳藥物濃度制作包藥珠核，育珠蚌的存活率和留核率大大降低，對育珠蚌解剖的結果發現，部分珍珠囊破損，珠核脫落，其原因可能是大珠核附著的藥物比較多，黑化細胞小片并腐蝕珍珠囊壁，引起育珠蚌藥物中毒。因此對于不同規格的珠核，藥物的濃度也不一樣。

3.2 包藥珠核促進育珠蚌傷口愈合

育珠蚌植入2.5 mm的普通珠核后，一般需要10 d左右傷口可以愈合，而植入同規格的包藥珠核后，傷口在3～5 d即可愈合。極大的降低了傷口感染致病菌的幾率，減少壞珠的數量，提高留核率。同時，中藥黃芪的益補作用可以更快地促進育珠蚌珍珠質的分泌，提高優質珠的數量，縮短育珠時間。

3.3 藥物濃度對珍珠品質的影響

基于珍珠養殖戶長期養殖經驗的基礎上，實驗選取的藥物濃度范圍安全可靠，不會造成育珠蚌中毒死亡，而且實驗結果(圖3)也表明，在此濃度范圍內，育珠蚌的存活數量并沒有明顯的變化。然而，留核率和優質珠率隨著黃芪濃度、黃霉素濃度和土霉素濃度的升高，表現出先增加后減小的特點。從對育珠蚌的解剖結果來看，過高的藥物濃度導致細胞小片黑化，腐蝕珍珠囊，增加脫核數。所以，優化包藥珠核的藥物濃度對于提高珍珠的品質十分重要。此外，中藥黃芪因產地、采收時間和貯藏條件的不同，藥效也會有所不同。因此在選取黃芪時，應根據黃芪的質量標準，盡量選取道地藥材。多項研究表明，山西的蒙古黃芪中黃芪甲苷、總黃酮、多糖的含量高于其他產地的黃芪，因此本實驗選用了山西蒙古黃芪。

圖3 黃芪藥液濃度、黃霉素濃度、土霉素濃度與存活率、留核率、優質珠率的關系

3.5 外界環境對存活率、留核率及優質珠率的影響

育珠蚌的存活率、留核率及優質珠率與外界的氣候條件和育珠水域環境密不可分。水體的pH值，含菌量、養料的多少可以人為地進行調控，但是水溫是不可控的因素之一，夏季的持續高溫或冬季的持續低溫，會增加育珠蚌的死亡率，并影響育珠蚌珍珠質的分泌。育珠水域的生態環境也會影響到珍珠的養殖，近年來，廣大養殖戶積極探索魚蚌混養的生態養殖方式，魚類可以為蚌類提供豐富餌料，減少有機肥和化肥的施用；蚌類可以凈化水體，二者相容共生，不但降低了投資成本，提高社會效益和生態效益，也有利于促進水域的健康和可持續性發展。