“分心木”水提物對大鼠單側腎缺血-再灌注損傷的防護作用

張 偉 陳雪潔 劉 蓉 肖朝江 沈 磊 田新雁 姜 北*

1.大理大學藥物研究所，云南 大理 671000；2.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000

腎缺血-再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指在腎臟缺血的基礎上恢復血流后，損傷反而加重的現象，是引發急性腎損傷和腎衰竭的重要因素[1]。RIRI常見于休克復蘇、腎臟手術、腎移植等疾患[2]。研究[3-4]認為，缺血-再灌注后自由基大量生成引發的細胞氧化損傷，是RIRI后腎功能受損的重要機制。其中黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)系統是RIRI時自由基增加的重要途徑。因此，干預RIRI時XOD的水平，減少自由基的生成是減輕RIRI的有效途徑。

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物。分心木(Diaphragma juglandis fructus,DJF)，藥材拉丁名為Xeloseptum juglandis，為核桃果實子房室的木質中隔，是漢族、白族、維吾爾族等多個民族以及民間常用藥材。民間主要用于治療腎虛遺精、遺尿、淋病、血尿、帶下、瀉痢以及失眠多夢等多種疾病，有健脾補腎的功效[5]；另外《山西中藥志》中明確記載：“分心木利尿清熱，治淋病尿血，暑熱瀉痢等癥?！爆F代藥理研究[6-7]結果顯示，分心木有抑制黃嘌呤氧化酶、抗氧化、抗炎、抑菌等活性。本課題組曾對云南分心木進行了初步的研究，從中分離鑒定了齊墩果酸、柚皮素、兒茶素等近二十個成分，對分心木的化學成分有了初步的認識[7]。鑒于分心木主要用于泌尿系統病癥，但目前有關分心木對腎缺血-再灌注損傷是否有保護作用以及作用機制尚不清楚，因此本研究擬通過構建大鼠腎臟缺血-再灌注損傷模型，探討云南分心木水提物對腎臟缺血-再灌注損傷的防治作用，為深入研究開發利用分心木的藥用價值提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2019-0004。動物實驗完全依照大理大學醫學倫理委員會及大理大學藥學院實驗動物管理委員會的相關規定進行。

1.2 樣品和試劑 實驗用分心木(DJF)材料2019年購于云南省大理市漾濞縣。肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、BCA總蛋白定量測試盒(貨號依次為：C011-2-1、CO13-2-1、A002-1-1、A001-3-2、A045-4-2、A003-2-2)購于南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器 酶標儀(賽默飛世科爾科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋電器公司)；多樣品組織研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)；BX53F正置顯微鏡(Olympus公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；大鼠獨立通氣籠(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)。

2 方法

2.1 供試樣品的制備 取干燥分心木，粉碎后過120目篩，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸餾瓶中，加入500 mL蒸餾水，85 ℃回流提取3次，冷卻后過濾，合并濾液，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥12.5 g)得分心木水提物樣品DJF-W。

2.2 建模和分組 40只SD大鼠隨機分為4組：對照組、模型組、DJF-W高、低劑量組，每組10只。各組大鼠適應性喂養1周后，進行藥物干預。DJF-W凍干粉以蒸餾水溶解，高劑量組和低劑量組分別給予1 g/kg和0.5 g/kg劑量的 DJF-W 灌胃，連續用藥14 d，1次/d，灌胃體積為1 mL/100 g，對照組及模型組給予等量的蒸餾水灌胃。末次灌胃后1 h，采用切除大鼠右腎、夾閉左腎腎動脈45 min，再灌注24 h的方法建立RIRI模型[8]。實驗動物均于術前禁食12 h，自由飲水。各組動物以0.4 mL/100 g劑量的水合氯醛(10%)腹腔注射，待其充分麻醉后，仰臥位固定于加熱鼠板，備皮，消毒，沿腹白線逐層切開，游離右側腎動脈并永久性結扎，切除右腎并鈍性分離左側腎動脈，將模型組及DJF-W高、低劑量組大鼠的左側腎動脈用無損傷動脈夾夾閉45 min；對照組不進行夾閉，逐層縫合、關閉腹腔、消毒。術中應用37 ℃生理鹽水使大鼠腹腔保持充分的水化。

2.3 取材及生化指標測定 術后24 h，使用負壓采血管于大鼠腹主動脈取血，室溫靜置30 min后，3500 rpm離心15 min，收集上層血清，置于-20 ℃備用，按照試劑盒說明書測定肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活力；取腎組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重，每只大鼠取50 mg左右組織，按1∶9的比例加入0.9%生理鹽水，機械勻漿，3500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的腎臟組織勻漿。按試劑盒說明書測定黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性。

2.4 腎組織形態學病變檢測 取相同部位腎組織，經生理鹽水沖洗后，常規取材，脫水，包埋，制片。腎組織切片H&E染色，在光學顯微鏡下觀察并描述。

2.5 數據處理 數據采用mean±SD在表格表示，SPSS 20.0軟件進行統計學分析，進行單因素方差分析(One-Way ANOVE)比較組間差異，P< 0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 RIRI模型構建情況 進行缺血-再灌注處理的腎臟，在該過程中發生的變化如圖1，用無損傷動脈夾阻斷腎臟血供時，腎臟由鮮紅色會逐漸變為紫黑色，45 min后松開動脈夾，5 min內腎臟顏色會逐步恢復。

(從左到右依次為：正常、缺血、再灌注時的腎臟)圖1 大鼠腎臟-再灌注時腎臟變化情況圖

3.2 各組大鼠血清及腎組織生化指標的比較

3.2.1 腎臟功能指標變化 DJF-W對大鼠血清中Cr和BUN水平的影響情況見表1，與對照組比較，模型組的大鼠血清Cr和BUN水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低Cr和BUN的水平(P<0.05)，低劑量樣品效果相對較弱，樣品效應呈現劑量依賴性。

表1 分心木水提取物對RIRI大鼠模型Cr和BUN水平的影響

3.2.2 氧化應激相關指標變化 分心木水提取物對大鼠血清中SOD與MDA以及腎組織中XOD活力水平的影響情況見表2，與對照組相比較，模型組大鼠血清中MDA及腎組織中XOD的水平明顯升高(P<0.01)，且血清中SOD的水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低MDA和XOD的水平(P<0.05)，并且可顯著提高SOD的水平(P<0.01)，低劑量樣品效應最弱，樣品效應呈現劑量依賴性。

表2 分心木水提取物對RIRI大鼠模型XOD、SOD和MDA水平的影響

3.2.3 腎組織形態學變化 分心木水提物對大鼠腎臟形態學的影響如圖2，將腎組織切片用H&E染色，于200倍數視野下進行圖片采集，可以明顯看出對照組腎小球和腎小管結構清晰，腎小管邊界完整，上皮細胞排列整齊，緊密。與對照組相比，模型組缺血45 min再灌注24 h后的腎臟表現為明顯的結構破壞，腎小管上皮細胞可見腫脹壞死，刷狀緣脫落，炎癥細胞浸潤，腎小管嚴重擴張，腎小管細胞邊界不明顯，腎小管壞死，腎小球嚴重損傷。與模型組相比，分心木水提取物有不同程度的減輕RIRI所致的腎損害作用，其中高劑量水提取物的效果最為明顯。

A:對照組；B:模型組；C:DJF-W(H)組；D:DJF-W(L)組白色箭頭：腎小管結構病變;白色圓圈：炎癥細胞浸潤；白色方框：腎小球損傷圖2 大鼠腎臟病理切片圖(×200，標尺：100 μm)

4 討論

腎臟是高血流灌注器官，良好的血液循環是腎臟組織排除代謝產物和獲取養分的基礎[9]。哺乳動物體內存在有黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，XDH)，可通過翻譯后修飾轉化為XOD[10]，XDH占機體XDH和XOD總活力的90%[11]。腎缺血時，次黃嘌呤和XOD大量堆積[12]，再灌注后，次黃嘌呤在XOD和O2的共同作用下生成大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)[13]。ROS極易與各種細胞結構成分發生反應，干擾氧化應激系統引起細胞氧化損傷[14]，進而導致腎臟結構破壞及功能障礙。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是機體抗氧化酶系統中的關鍵酶之一[4]，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是自由基介導的脂質過氧化物反應的穩定代謝產物[15]，二者的水平可間接反應機體抗氧化能力和氧化損傷的程度。血清中BUN和Cr是反應腎臟功能的敏感性指標，可間接反應機體腎功能的強弱。

近年來，有關分心木的研究越來越多，結果表明分心木提取物具有較強的抗氧化活性[7,16]；其中的酚酸類和黃酮類化合物均具有良好的體外XOD抑制作用[6]。本文分心木水提物對RIRI的防護作用研究結果顯示，與對照組相比，模型組XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯上升，SOD的活性明顯下降，表明大鼠腎臟缺血-再灌注后，機體出現了氧化損傷，腎臟功能下降；與模型組相比，分心木水提物1 g/kg組的大鼠XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯降低，體內SOD活性提高，表明預處理分心木水提物可通過抑制XOD的活性干預ROS的來源，提高機體的抗氧化能力，減輕氧化應激的損傷，改善RIRI后的腎功能，因此對腎缺血-再灌注損傷具有一定程度的防治作用。本研究結果進一步證實了分心木傳統上用于腎虛相關性疾病、主要治療生殖系統與泌尿系統病癥的合理性[17]，可為臨床前研究提供實驗依據，為后續分心木的開發利用提供思路。