類固醇激素分泌功能的腎上腺三維培養(yǎng)體系的建立*

郭雅婕，王逸夫，郭冰倩，姜經(jīng)航，葉 雨，陳虹霏，陳 陽，廖金玲，莫曾南，，蔣永華△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基因組與個體化醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧 530007）

由于腎上腺動物模型常常受到胎兒腎上腺結(jié)構(gòu)、類固醇生成途徑和妊娠內(nèi)分泌學(xué)的顯著物種特異性差異限制，目前關(guān)于腎上腺器官模型建立的研究較少。體外模擬具有類固醇分泌功能的腎上腺皮質(zhì)三維培養(yǎng)體系，有助于從細胞及分子水平上對腎上腺疾病致病機制及藥物治療的研究。如先天性腎上腺增生（CAH）[1]，腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）[2]等疾病。

目前，人類腎上腺類器官培養(yǎng)研究，包括胚胎組織碎片培養(yǎng)[3]以及原代胚胎腎上腺細胞來源的三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)[4]，前者保留腎上腺形態(tài)、細胞活力和持續(xù)的高類固醇生成活性，對于ACTH 刺激和抑制都有特定的生物學(xué)反應(yīng)，但其組織塊培養(yǎng)容易使培養(yǎng)團塊中心性壞死；后者主要描述一群不同胎齡來源下，具有重建組織和功能分區(qū)結(jié)構(gòu)能力的干細胞群，維持了人類胚胎腎上腺發(fā)育過程中的特定功能階段，但其沒有產(chǎn)生激素的特有內(nèi)分泌功能。

以上兩種培養(yǎng)方案都僅靠細胞黏附作用成球生長，培養(yǎng)球體中心細胞容易缺氧導(dǎo)致細胞死亡，且其培養(yǎng)條件未滿足其腎上腺皮質(zhì)區(qū)域生長遷移特點。另外，典型的Wnt 信號通路對胚胎的建立和腎上腺皮質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用[5-6]。有研究表明，腎上腺中富集于β-catenin 的fibroblast growth factor receptor-2（Fgfr2）通過調(diào)節(jié)細胞黏附連接的豐度和聚集特性，維持腎上腺皮質(zhì)組織形態(tài)[7]。因此，本研究將兩者結(jié)合，通過Matrigel 構(gòu)建三維培養(yǎng)骨架，添加fibroblast growth factor（FGF2）和激活Wnt信號通路的小分子化合物CHIR99021、R-spondin1，構(gòu)建具有類固醇激素分泌功能且受促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）調(diào)控的腎上腺三維培養(yǎng)體系，為腎上腺皮質(zhì)疾病的研究奠定細胞生物基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織來源

人胚胎腎上腺組織取自2019—2020 年于廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院流產(chǎn)胚胎樣本。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（KY-0096）。

1.2 主要試劑和儀器

低黏附培養(yǎng)皿（Corning，3471），低生長因子無酚紅的基質(zhì)膠（356231GFR-Matrigel，Corning），RPMI 1640（Gibco，C11875500BT），DMEM/F12 培養(yǎng)基（12634010，Life technologies），TL 酶（Roche，5401020001），DNase Ⅰ酶（Roche，10104159001），無血清培養(yǎng)代替物N2（17502048，Life technologies），B-27 supplement minus vitamin A（12587010，Life technologies），谷氨酰胺（Gbico，25030081），血清FBS（Gibco，21 700075；HyClone，3007.03），生長因子FGF2（100-18C，Peprotech），原代細胞抗生素primocin（ant-pm-1，Invivogen），CHIR99021（4423，Tocris），R-spondin1（4645-RS，Bio R&DTechne），促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH（12279-41-3，MedChemExpress），抗 體CYP17A1（sc-374244，Santa），Dax1（ab97369，abcam），二抗Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-mouse IgG（1∶500，ab150112，Abcam），Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG（1∶500，ab150061，Abcam），DAPI（4083S，CST）。ELISA（DEHA，PROG，PREG，Cortisol）試劑盒購自江蘇科晶生物有限公司。凝膠成像分析系統(tǒng)（Image Quant LAS500），Epoch2 微孔板分光光度計（Gen5TSCH 2.06 軟件），Roche light Cycler 480 RTqPCR 儀，共聚焦顯微鏡（TCS SP8，Laika Microscope System Shanghai Trading Co，Ltd）。

1.3 溶液的配制

轉(zhuǎn)移液：RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入10% FBS。消化液：RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入0.1 mg/mL TL，1 mg/mL DNase Ⅰ。含血清培養(yǎng)液：DMEM/F12 培養(yǎng)基中加入10%FBS，1X L-glutamine。無血清培養(yǎng)液：DMEM/F12 培養(yǎng)基中加入1X N2，1X B-27 supplement minus vitamin A，1X L-glutamine，100 μg/mL primocin；再添加100 ng/mL FGF2，1.5 μmol/L CHIR99021，5 ng/mL recombinant human R-spondin1，200 nmol/L ACTH。

1.4 單個細胞的制取

取手術(shù)流產(chǎn)胚胎腎上腺，嚴格遵循無菌操作原則，樣本放入轉(zhuǎn)移液中保存。取回的胚胎腎上腺樣本放入EP管中，用PBS沖洗，去除血液，表面雜質(zhì)。清理干凈的組織放入培養(yǎng)皿中用眼科剪剪碎組織，重懸至消化液消化（37 ℃，20 min），待肉眼看不到組織碎塊用含10%血清的PBS終止，過100 μm的篩網(wǎng)獲得單個細胞，最后用含1%血清的PBS清洗兩次，重懸計數(shù)。

1.5 球狀體的構(gòu)建

第1 天，將Matrigel 與冰DMEM/F12 以1∶20 體積稀釋混勻加入低黏附培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱預(yù)包被，待1 h 培養(yǎng)基呈膠狀后棄上清液。將單個細胞懸液再用培養(yǎng)液重懸調(diào)整細胞濃度至1.5×105/mL，沿培養(yǎng)皿壁邊緣緩緩加入孔內(nèi)，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）。第2 天，棄上清，Matrigel 與培養(yǎng)基以1∶40 體積稀釋加入培養(yǎng)皿內(nèi)。第3 天成球后，用不含Matrigel 的培養(yǎng)基換液，每隔3 d 更換1 次培養(yǎng)基，每隔1 周傳代。第1～第11 天，在DMEM/F12+10% FBS+1% Glu 條件下培養(yǎng)。第12 天后，無血清培養(yǎng)：DMEM/F12+N2+B27+1%Glu。通過不同培養(yǎng)時間添加因子，進行以下比較：（1）第12 天，添加FGF2，48 h 后光鏡下觀察其形態(tài)變化；（2）第15 天，再添加CHIR99021、R-spondin1，48 h 后測定Wnt 信號通路相關(guān)基因的表達，及蘇木精伊紅染色。（3）第18天，鑒定腎上腺皮質(zhì)關(guān)鍵基因及蛋白的表達后，ACTH刺激球體，48 h后測定上清液激素水平與ACTH刺激前比較。

1.6 球狀體的傳代，凍存和復(fù)蘇

用巴氏吸管轉(zhuǎn)移細胞球至15 mL 無菌離心管中，300 g 離心3 min，棄上清，加入3 mL Dispase 吹打重懸于60 mm 培養(yǎng)皿，放入培養(yǎng)箱酶解消化30 min。顯微鏡觀察，球狀體呈2～3 個細胞團塊，用PBS 清洗小細胞團殘留酶及膠狀雜質(zhì)。按照以上球狀體構(gòu)建步驟，進行預(yù)包被和換液。以1∶3 比例擴增傳代。凍存液DMSO/FBS以1∶9比例凍存球狀體，液氮保存。復(fù)蘇時凍存管速融37 ℃至小冰晶，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管含10%FBS的1640培養(yǎng)基吹打混勻，300 g離心3 min，去除上清液，培養(yǎng)。

1.7 球狀體包埋切片

將球狀體放入4%的多聚甲醛固定36 h，瓊脂糖凝膠包被20～30個類器官/塊，再固定24 h。酒精梯度脫水（50%，70%，80%，90%，95%兩次，100%兩次）各20 min；二甲苯透明15 min重復(fù)2次；浸蠟3 h（65 ℃烘箱）。石蠟包埋（-20 ℃冰箱過夜）。切片機切4 μm厚度切片，粘載玻片，干燥。

1.8 蘇木精—伊紅染色觀察Wnt 信號通路類器官形態(tài)特征

石蠟切片用二甲苯脫蠟10 min重復(fù)3次，酒精梯度透明（95%，80%，70%）各1 min，自來水沖洗1 min，甩干。滴加蘇木精染液染5～10 min，自來水沖洗1～2 min；鹽酸酒精分化液分化數(shù)秒，水洗；滴加返藍液數(shù)秒，水洗1～2 min 甩干；滴加80%乙醇脫水1 min，再滴加伊紅染液染色30～60 s。依次浸入80%乙醇，95%乙醇調(diào)色脫水，顯色后浸入無水乙醇脫水2 min。透明封片，顯微鏡觀察。

1.9 免疫熒光染色觀察球狀體中類固醇生成細胞標(biāo)記物的表達

脫蠟、透明同上。EDTA水煮修復(fù)抗原，煮沸放入玻片，最低火力煮20 min；2% BSA 封閉（37 ℃，30 min）；一抗用2%BSA配制，混勻滴上組織（4 ℃，過夜）孵育；二抗（37 ℃，30 min）孵育；DAPI 染核?？篃晒馑p封片劑封片，共聚焦顯微鏡觀察。

1.10 透射電鏡的樣本制備與觀察

將10～20 個球狀體用2.5%戊二醛4 ℃冰箱固定3 h，固定好的樣本送至塞維爾生物科技制樣、切片、染色及拍照。

1.11 熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）測定關(guān)鍵基因的表達

用HiPure Universal RNA Kit（Magen）試劑盒提取細胞總RNA，PrimeScript RT Master Mix（TAKARA）逆轉(zhuǎn)錄。使用FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒，于Roche Light Cycler 96 RTqPCR儀進行RT-qPCR。反應(yīng)條件如下：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。得到CT 值后計算2-ΔΔCT得到目的基因相對表達量，目的基因及引物序列見表1。

表1 目的基因及引物序列

1.12 RT-qPCR產(chǎn)物電泳鑒定

提取細胞總RNA，行RT-qPCR，PCR產(chǎn)物電泳，配制3%瓊脂糖凝膠，加入核酸染料，1X TAE電泳緩沖液；置入電泳槽，每孔加入10 μL PCR 擴增產(chǎn)物；電壓120 V，電流40 mA，電泳時間40 min；成像觀察。

1.13 激素測定酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定細胞上清液激素

ELISA試劑盒，450 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（r2≥0.99）得到標(biāo)準(zhǔn)方程，代入樣本所測吸光度，公式計算得出對應(yīng)培養(yǎng)基上清中激素濃度。

1.14 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGF2 有利于體外類器官培養(yǎng)細胞的增殖球體的形成

光鏡下形態(tài)學(xué)觀察，Matrigel 包被在含血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)第1天可見大量雙細胞，第2天可見3～5 個細胞團，第5 天后細胞聚集成球，并隨著時間不斷增大。第12 天添加FGF2 生長因子后，球體直徑仍明顯增大，直徑可達約300 μm（圖1）。

圖1 光鏡下細胞成球過程及生長情況（×10）

2.2 Wnt信號通路激活劑的添加有利于類器官球體結(jié)構(gòu)的形成

RT-qPCR 結(jié)果顯示，添加Wnt 信號通路激活劑后，Wnt/β-catenin 信號下游蛋白β-catenin、CyclinD1的mRNA 表達水平升高（均P＜0.05）；GSK-3β、PPAR-γ表達水平組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。HE 染色結(jié)果對比顯示，在其小分子化合物的作用下，球狀體具有顯著腎上腺外層致密內(nèi)部疏松的組織特征，且與胚胎腎上腺結(jié)構(gòu)相似（圖2）。

圖2 Wnt 信號通路類器官形態(tài)特征對比圖（HE染色）

表2 qRT-PCR 檢測GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 和PPAR-γ的mRNA相對表達水平 ±s

表2 qRT-PCR 檢測GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 和PPAR-γ的mRNA相對表達水平 ±s

2.3 獲得的腎上腺類器官具有皮質(zhì)激素合成功能

免疫熒光染色結(jié)果顯示，球狀體中類固醇生成細胞標(biāo)記物DAX1、CYP17A1的表達（圖3）。電泳分析結(jié)果顯示，球狀體具有類固醇生成因子SF-1的表達，甾體生成酶的基因表達CYP11A1、CYP11B1、CYP17A1、HSD3B2，以及ACTH 受體黑皮質(zhì)素2 受體（melanocortin 2 receptor，MC2R）的表達（圖4）。透射電鏡結(jié)果顯示，微觀結(jié)構(gòu)下球狀體內(nèi)部細胞呈現(xiàn)大量脂滴（LD），擴大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER），豐富線粒體（M），滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（SER），細胞核（N）（圖5）。

圖3 球狀體DAX1、CYP17A1的免疫熒光染色（×20）

圖4 電泳觀察球狀體所含各類型細胞的標(biāo)志物表達

圖5 球狀體中細胞的微觀結(jié)構(gòu)（×8.0 k）

2.4 獲得的類器官受ACTH信號調(diào)控

ELISA 結(jié)果顯示，與未添加ACTH 組比較，添加ACTH組刺激后，類器官培養(yǎng)上清液中類固醇相關(guān)激素包括孕酮、皮質(zhì)醇均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而兩組孕烯醇酮、脫氫表雄酮比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 ELISA檢測球狀體培養(yǎng)上清液的激素水平ng/mL， ±s

表3 ELISA檢測球狀體培養(yǎng)上清液的激素水平ng/mL， ±s

3 討論

本研究利用基質(zhì)膠為體外生成的球狀體提供了生長的支架。低生長因子（growth factor reduce，GFR）的Matrigel 基底膜基質(zhì)適用于對基質(zhì)成分要求嚴格的實驗，如細胞信號通路和細胞因子的研究等。本課題組采用GFR-Matrigel 通過添加各種腎上腺相關(guān)生長因子和小分子化合物方法，以模擬細胞體內(nèi)生長環(huán)境的體外培養(yǎng)。該方法依賴對腎上腺相關(guān)信號通路的激活，如FGF2、Wnt、PKA信號通路。因此本研究添加了以下信號激活相關(guān)因子：生長因子FGF2，調(diào)節(jié)Wnt 信號通路[5，8]的CHIR99021和R-spondin1，以及ACTH。

腎上腺皮質(zhì)組織的更新和重塑，對于三維立體模型的建立至關(guān)重要。典型的Wnt 信號通路對胚胎的建立和腎上腺皮質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用[5-6]。在腎上腺早期發(fā)育過程中，Wnt/β-catenin 信號通過維持祖細胞處于未分化狀態(tài)[9]，在皮質(zhì)向心更新中發(fā)揮重要作用[10]。此外，Wnt 信號通路還可以通過誘導(dǎo)旁分泌因子直接影響細胞的遷移、黏附和極性[9，11]，如FGF 信號通路[7，12]來調(diào)控形態(tài)發(fā)生。成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）的表達對維持皮質(zhì)細胞的生長和增殖至關(guān)重要[12-13]。因此，添加Wnt信號通路激活劑CHIR99021和R-spondin1和生長因子FGF2，維持了球狀體內(nèi)皮質(zhì)細胞的生長和增殖，促進皮質(zhì)的更新有利于三維球體的重塑。本文對其形態(tài)學(xué)觀察，可見球狀體直徑有明顯的增加，且具備腎上腺外層致密內(nèi)部疏松的組織特征。類固醇細胞透射電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)特點有以下幾點：（1）擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及豐富的光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈髓鞘狀；（2）細胞線粒體較多、嵴清晰、呈半層狀；（3）胞質(zhì)內(nèi)有較多的脂滴。因此，從細胞學(xué)角度，腎上腺類器官微觀結(jié)構(gòu)下具備以上特征，免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示球狀體具有類固醇細胞標(biāo)志物DAX1、CYP17A1的表達，可初步得出球狀體內(nèi)具有類固醇生成樣細胞。

人腎上腺皮質(zhì)類固醇細胞產(chǎn)生的皮質(zhì)醇雄激素由HPA軸控制。ACTH通過激活cAMP依賴的蛋白激酶A（PKA）信號，刺激腎上腺束狀帶皮質(zhì)細胞產(chǎn)生皮質(zhì)醇[14-15]。腎上腺皮質(zhì)細胞表面的MC2R在介導(dǎo)ACTH 的分泌和隨后的類固醇形成中發(fā)揮重要作用[14，16]。因此，本實驗對PCR 產(chǎn)物電泳驗證了球狀體具有類固醇生成因子SF-1；甾體生成酶的基因（CYP11A1、CYP11B1、CYP17A1）[17]；以及MC2R基因的和糖皮質(zhì)激素合成的關(guān)鍵基因HSD3B2的表達。因此，在PKA 信號通路的調(diào)控下添加ACTH后，檢測到皮質(zhì)醇激素升高，進而模擬了腎上腺束狀帶細胞的生物學(xué)功能。

本文研究了一種目前較為前沿的利用Matrigel構(gòu)建體外擴增和分化人腎上腺細胞的三維培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)具有包含多種細胞類型，更加接近體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，有利于建立細胞間廣泛的鏈接和細胞通訊，進而有利于細胞的分化，能更好地用于模擬人類器官組織的發(fā)生過程及生物學(xué)功能[18]。通過添加激活腎上腺發(fā)育通路的小分子化合物，探索了胚胎腎上腺來源的細胞體外三維培養(yǎng)體系。本課題組對培養(yǎng)的腎上腺球狀體進行形態(tài)學(xué)、基因表達、蛋白表達和重要的體外功能包括腎上腺的激素分泌功能等方面進行驗證，說明其與腎上腺在組織、細胞及功能層面鑒定結(jié)果基本一致的腎上腺球狀體皮質(zhì)區(qū)域結(jié)構(gòu)[19-20]。為腎上腺體外模擬及治療提供了新策略。

本實驗通過電泳的方法，觀察其所含的細胞標(biāo)志物基因表達，但仍需進一步應(yīng)用免疫熒光技術(shù)將所用細胞類型完整標(biāo)記出來。為促進其更加穩(wěn)定的培養(yǎng)及鑒定，筆者將從培養(yǎng)基的制備、傳代方法、包埋切片等方面完善腎上腺的培養(yǎng)和標(biāo)本制備方法，向腎上腺類器官能大規(guī)模培養(yǎng)和廣泛鑒定發(fā)展，為發(fā)育生物學(xué)的研究提供一個基本的研究模型，有利于再生醫(yī)學(xué)、基因治療的研究。