CDC25C表達(dá)下調(diào)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16自噬和遷移能力的影響*

鄭方園，潘桂珍，鐘 婷，李婷玉，陳宇露，李京原，陳琪琦，陳 紅，王桂閩，陸小楠，莫發(fā)榮

（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021）

黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）是一種由黑色素細(xì)胞發(fā)展來的皮膚癌[1]，主要發(fā)生在皮膚上，有時(shí)也可發(fā)生在眼睛、口腔或腸道，但較少見，是一種多病因異質(zhì)性的病癥[2]，其亞型在起源、解剖部位、紫外線輻射的作用和突變特征上有所不同。SKCM 是惡性程度較高的一類腫瘤，五年生存率較低，目前治療方式多以用手術(shù)為主，但并不能達(dá)到完全切除干凈的效果，因此，了解影響SKCM發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，為尋找有效的綜合治療提供思路。

細(xì)胞分裂周期蛋白25（CDC25）由多基因家族編碼，包括CDC25A、CDC25B和CDC25C[3]，它們通過去磷酸化和激活CDK 在細(xì)胞周期階段之間的轉(zhuǎn)變中起重要作用，其中CDC25C是一種編碼磷酸酶的基因[4]，在G2/M期進(jìn)展中起主要作用[5]，因此本課題組推測(cè)可以通過調(diào)節(jié)CDC25C 的表達(dá)量對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，它的激活會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解以及細(xì)胞器受損，具有抗應(yīng)激、免疫、抗衰老和促腫瘤或抗腫瘤作用[6]，本研究旨在探索下調(diào)CDC25C后對(duì)SKCM B16細(xì)胞自噬和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

TCGA（the Cancer Genome Atlas）是一個(gè)匯集了多種癌癥基因圖譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，利用TCGA 可視化在線工具GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數(shù)據(jù)庫，選取其中的461例SKCM和558 例正常組織，分析這些組織中CDC25C的表達(dá)情況。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

SKCM B16細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（100 U/mL 青霉素以及100 mg/mL 鏈霉素）均購(gòu)自于WISENT 公司。細(xì)胞培養(yǎng)選用RPMI 1640 培養(yǎng)基并添加10%胎牛血清（FBS），另加1%雙抗（100 U/mL 青霉素以及100 mg/mL 鏈霉素）的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每1～2 d 需更換新鮮的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 慢病毒載體的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

CDC25C 低表達(dá)及陰性對(duì)照慢病毒質(zhì)粒（攜帶綠色熒光蛋白）由上海吉瑪公司合成，以每孔0.5×105個(gè)B16細(xì)胞接種于24孔板，每孔加入0.5 mL RPMI 1640 完全培養(yǎng)基搖勻，使細(xì)胞均勻平鋪于板底。以LV-CDC25C 為實(shí)驗(yàn)組，以LV-NC 為陰性對(duì)照組，加入經(jīng)慢病毒稀釋液（400 mL+500 mg/mL Polybrene）稀釋的慢病毒質(zhì)粒，37 ℃、5%CO2過夜。24 h 后移去細(xì)胞侵染后的慢病毒液，加入0.5 mL含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每1～2 d 需更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，利用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)情況評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。在此過程中，以不經(jīng)慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16 細(xì)胞作為空白對(duì)照（MOCK）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-qPCR）檢測(cè)CDC25C的表達(dá)

利用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Ta-KaRa）提取上述3 組細(xì)胞的RNA，以HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme）將所得RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CDC25C的表達(dá)，引物由TaKaRa公司合成（表1）。

表1 引物序列/（5’～3’）

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)LC3、p62、beclin1 的mRNA 表達(dá)

提取上述3組細(xì)胞的RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）用于qPCR 實(shí)驗(yàn)，qPCR 和數(shù)據(jù)收集基于StepOne plus熒光定量PCR儀，結(jié)果用GAPDH的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。qPCR 反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex 12.5 μL，TaqⅡ1 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，另加8.5 μL ddH2O至總體系為25 μL。RTqPCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；最后添加熔解曲線：95 ℃5 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。LC3、p62、beclin1 相對(duì)于GAPDH 的表達(dá)使用2－ΔΔCT法計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化。RT-qPCR 引物由TaKaRa 公司合成（表2）。

表2 引物序列（5’～3’）

1.6 Western blotting 法檢測(cè)LC3、p62、beclin1 的蛋白表達(dá)

對(duì)上述3組細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，采用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。于蛋白上清液中加入4X蛋白上樣緩沖液（Solarbio），經(jīng)95 ℃變性后，利用聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）將目的蛋白分離，之后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉2 h后，用PBST沖洗3次，每次10 min。將封閉液洗凈后，分別孵育相應(yīng)的抗體（LC3抗體購(gòu)自于ProteinTech公司，p62和beclin1抗體購(gòu)自于Abcam公司，GAPDH、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自于fdbio公司），一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，一抗和二抗孵育結(jié)束后分別用PBST沖洗3次，每次10 min。ECL化學(xué)顯影后拍照觀察自噬相關(guān)分子的表達(dá)情況。采用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，并以目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白灰度的比值反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Wound healing assay法評(píng)估細(xì)胞遷移能力

將上述3 組細(xì)胞以每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用100 μL 的移液器tip吸頭于培養(yǎng)板底部輕輕劃出垂直劃痕，用PBS沖洗3次，洗去漂浮細(xì)胞，之后繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察并拍攝0 h、12 h、24 h細(xì)胞水平遷移的照片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。最后，按以下公式計(jì)算劃痕細(xì)胞遷移能力：細(xì)胞遷移率=[劃痕寬度（0 h）-劃痕寬度（12 h或24 h）]/劃痕寬度（0 h）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析。計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析CDC25C在SKCM中的表達(dá)

經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫分析461例SKCM組織與558例正常組織的CDC25C基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示SKCM 組織中CDC25C基因表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中SKCM CDC25C基因表達(dá)

2.2 成功構(gòu)建CDC25C表達(dá)下調(diào)的B16細(xì)胞株

CDC25C低表達(dá)慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察3 組細(xì)胞綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP 在LV-NC 組和LV-CDC25C 組中高度表達(dá)，在MOCK組中沒有檢測(cè)到GFP信號(hào)（圖2A）。以RT-qPCR方法獲得3 組細(xì)胞cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示含有CDC25C（970 bp）和β-actin（709 bp）的cDNA片段，其中LV-CDC25C組CDC25C表達(dá)量降低（圖2B）。結(jié)果表明成功構(gòu)建CDC25C表達(dá)下調(diào)的B16細(xì)胞株。

圖2 CDC25C表達(dá)下調(diào)的B16細(xì)胞株的構(gòu)建及確認(rèn)

2.3 CDC25C表達(dá)下調(diào)激活細(xì)胞自噬

為了解CDC25C表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞自噬的影響，首先從mRNA 水平研究CDC25C與自噬相關(guān)分子的相互影響。對(duì)3組B16細(xì)胞提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)RT-qPCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，CDC25C表達(dá)下調(diào)后自噬相關(guān)分子LC3和p62mRNA表達(dá)量增加（P＜0.05），beclin1 mRNA表達(dá)量增加（P＜0.01），見圖3。

圖3 下調(diào)CDC25C對(duì)B16細(xì)胞自噬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

為進(jìn)一步了解CDC25C 表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞自噬相關(guān)分子在蛋白表達(dá)水平的影響，對(duì)3 組B16 細(xì)胞提取總蛋白后，經(jīng)Western blotting 分析，結(jié)果顯示CDC25C 表達(dá)下調(diào)后自噬相關(guān)分子LC3、p62、beclin1蛋白表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），見圖4。

圖4 下調(diào)CDC25C對(duì)B16細(xì)胞自噬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

2.4 CDC25C表達(dá)下調(diào)抑制B16細(xì)胞的遷移能力

為了解CDC25C 表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，經(jīng)劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，劃痕后12 h、24 h，對(duì)照組劃痕面積縮小，實(shí)驗(yàn)組劃痕面積無明顯改變（圖5A）。與對(duì)照組相比，下調(diào)CDC25C 后B16 細(xì)胞遷移率降低（P＜0.05）（圖5B）。

圖5 下調(diào)CDC25C對(duì)B16細(xì)胞水平遷移能力的影響

3 討論

CDC25C 高表達(dá)于各種癌癥中，如肝細(xì)胞癌[7]、食管鱗狀細(xì)胞癌[8]以及肺癌[9]等，本課題組通過利用TCGA 可視化在線工具GEPIA 數(shù)據(jù)庫檢測(cè)出CDC25C 高表達(dá)于SKCM 中，細(xì)胞自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，并且是一種避免細(xì)胞死亡以及細(xì)胞對(duì)應(yīng)激等刺激的適應(yīng)性反應(yīng)[7]，自噬參與癌癥的發(fā)展和預(yù)防，在初始階段，促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制癌變，而在癌癥發(fā)展進(jìn)程中，則誘導(dǎo)癌細(xì)胞存活[10]，在Lou等[11]和Sui等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，小分子誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡有助于增強(qiáng)化療或放療的抗腫瘤活性。LC3（light chain 3）目前是在自噬過程中被研究的最廣泛的蛋白，且被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞自噬最關(guān)鍵的分子標(biāo)志物[13]，它參與了自噬體膜的形成，其中包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C 端被Atg4 蛋白酶切割后變成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在的分布于細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）發(fā)生偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并且定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬過程時(shí)，胞漿型LC3-Ⅰ會(huì)被相關(guān)的酶水解，去除一段多肽，使之轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3-Ⅱ[14]。有研究表明[15]p62是選擇性自噬的效應(yīng)物及自噬的底物，其與LC3結(jié)合可促進(jìn)自噬的形成。在早期的有絲分裂過程中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）對(duì)p62 蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用[16]，相關(guān)研究表明活化的CDK1/周期蛋白B可激活CDC25C[17]，而p62 與CDK1/細(xì)胞周期蛋白B 之間具有相互調(diào)節(jié)的作用，在細(xì)胞生存和細(xì)胞周期過程中相當(dāng)于一個(gè)新的調(diào)節(jié)器[18]，且自噬參與了致癌蛋白的降解，而p62本身就被認(rèn)為具有潛在的致癌功能，beclin1通過參與了Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）復(fù)合物的形成，在自噬過程中起著核心作用，并且還參與了PI3K復(fù)合物的形成和自噬體的組成[19]，它們通過調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，因此本文推測(cè)CDC25C 下調(diào)通過影響自噬過程的發(fā)生進(jìn)而影響SKCM的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式并通過嘌呤霉素篩選成功構(gòu)建攜帶有GFP 綠色熒光穩(wěn)定低表達(dá)CDC25C 的細(xì)胞株并通過熒光顯微鏡直觀觀察，為進(jìn)一步探索CDC25C 下調(diào)對(duì)自噬相關(guān)過程的影響，本課題組分別從分子水平和蛋白水平驗(yàn)證CDC25C下調(diào)后自噬主要相關(guān)分子LC3、p62 以及beclin1 的變化情況，分子水平RT-qPCR結(jié)果顯示CDC25C下調(diào)后轉(zhuǎn)染下調(diào)CDC25C 慢病毒載體的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比LC3、p62以及beclin1的表達(dá)水平均升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明下調(diào)該基因后促進(jìn)自噬過程的發(fā)生，后面本課題組又通過Western Blotting 技術(shù)在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了這一結(jié)果，由于自噬分子LC3Ⅰ在活化后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ，因此在分子水平檢測(cè)活化后LC3的相關(guān)表達(dá)情況，在蛋白質(zhì)水平可以明顯看到LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩個(gè)條帶，由于LC3 的轉(zhuǎn)化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，因此本文通過檢測(cè)LC3Ⅱ與內(nèi)參蛋白的比值來反映自噬水平[20]。通過細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，在劃痕后的0 h、12 h、24 h中，轉(zhuǎn)染慢病毒載體的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞的水平遷移能力降低，說明下調(diào)CDC25C 后在一定程度上抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果表明與正常組織相比CDC25C 在SKCM 中高表達(dá)，下調(diào)CDC25C 后能夠影響SKCM 的增殖和遷移能力，在自噬水平的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，本課題組發(fā)現(xiàn)下調(diào)CDC25C 能夠促進(jìn)自噬過程的發(fā)生，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以上結(jié)果可以為SKCM除手術(shù)治療外的免疫靶向治療提供新思路。