白細胞分化抗原6與進展性慢性腎臟病的相關性研究*

黃海珍，馮 濤，黃學意，陸玉甘，黎 偉

（廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腎內科，南寧 530007）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）是指各種原因引起的腎臟結構和功能障礙等于大于3個月，是不可逆的、進展性的疾病[1]。CKD進展是功能性的腎單位減少和腎臟結構上腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質炎癥浸潤和纖維化的過程，其診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和有創(chuàng)的腎活檢，缺乏有效早期預測診斷指標。因此，尋找早期診斷的分子標志物對于改善CKD 的預后至關重要。白細胞分化抗原6（cluster of differentiation 6,CD6）是淋巴細胞的表面糖蛋白[2]，在胸腺發(fā)育、T 細胞活化和免疫應答中起關鍵作用[3-4]，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體糖蛋白超家族[5]。有研究報道，CD6 與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]和自身免疫性疾病[7]有密切的關系，與腎移植后進行性腎小管萎縮和腎間質纖維化相關[8]。目前CD6 在CKD 發(fā)生發(fā)展中的作用尚未有相關研究。本研究發(fā)現(xiàn)CD6 可作為CKD 進展的分子標志物，其作用機制可能是腎臟的免疫細胞浸潤，為預防CKD進展提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEO 芯片數(shù)據(jù)處理和分析 應用R“GEOquery”包[9]從GEO 數(shù) 據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載數(shù)據(jù)集GSE60861及相關臨床資料[10]。使用R“l(fā)imma”包[11]對表達數(shù)據(jù)進行矯正，組間歸一化處理。使用Wilcoxon 檢驗行基因差異表達分析。用R“clusterProfiler”包[12]對差異表達基因本體（gene ontology,GO）分析和通路富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）。使用CIBERSORT 工具篩選出免疫浸潤的樣本，行CD6與免疫細胞相關性分析。

1.2 單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）模型構建 6 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，體重18～20 g，取自廣西醫(yī)科大學動物中心（許可證號：SYXK 桂2014—0003），所有手續(xù)均由廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。將小鼠置于光/暗周期為12 h，（23±1）℃和55%的濕度的環(huán)境，可自由獲取食物和水。隨機分為4組（n=5）：假手術組（Sham）、術后7 d 組（UUO-7 d）、術后14 d 組（UUO-14 d）、術后21 d 組（UUO-21 d）。按照0.2 mL/10 g的劑量腹腔注射1.25%阿佛丁麻醉，取左旁正中切口暴露左側輸尿管,在其中上1/3 處游離輸尿管并結扎剪斷輸尿管。sham 組只游離輸尿管而不結扎。術后第7，第14，第24天，在麻醉狀態(tài)下迅速從小鼠身上獲取梗阻側腎臟。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測腎組織的CD6 和TGFβ1 相對表達量 使用TRIzol Reagent 提取腎組織總RNA，取1 μg 總RNA進行反轉錄成cDNA，對CD6、TGFβ1行RT-qPCR擴增。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 本文所有統(tǒng)計分析均使用R 軟件（版本4.0.2）或SPSS（版本22.0）。采用Kaplan-Meier法比較的總生存率；采用Cox回歸分析風險因素；采用R“timeROC”包繪制ROC 曲線；采用Pearson 和Spearman 相關分析進行相關性分析；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD6與CKD進展的相關性分析 隊列在獲取腎組織開始隨訪，時間為3～151個月，隊列平均年齡47.03 歲，男性占58.8%，腎小球濾過率平均值約63.57 mL/min/1.73 m2。CKD 進展定義為在隨訪時間內達到終末期腎病或者血肌酐翻倍，而未達到終末腎病或是血肌酐翻倍的為穩(wěn)定組。與CKD 穩(wěn)定組相比，CD6 mRNA 在進展組中表達水平升高；在不同CKD 分期的CD6 mRNA表達水平有統(tǒng)計學差異（圖1A～圖1B）。以CD6 mRNA的中位數(shù)為界值，將GES60861隊列分為CD6 高、低表達兩組。Kaplan-Meier 顯示兩組的總生存率有差異，ROC 曲線下面積（AUC值）1年、3年、5年分別達到0.877、0.853和0.948（圖1C～圖1D）。單因素COX 分析出性別、肌酐和CD6 與CKD 進展顯著相關（表1），在多因素COX 模型中，CD6 mRNA 升高是CKD 進展的危險因素（HR=3.673，P＜0.001），見表2。

圖1 GSE06861中CD6表達水平與CKD臨床特征的相關性分析

表1 CKD病程進展危險因素的單因素COX回歸分析

表2 CD6與性別、血肌酐的多因素COX回歸分析

2.2 差異基因的GO 和KEGG 分析 以| log2FC |＞1.0 且P＜0.01 為標準，在CD6 高、低表達的兩組樣品中篩查出了76個差異基因。GO分析表明差異基因主要參與免疫相關反應（圖2A）。在KEGG 富集分析，以校正后P＜0.05 為標準，共富集了到33 條KEGG 信號通路，除外關于腫瘤和其他疾病特有通路，主要涉及Th1/Th2、Th17 等淋巴細胞分化、細胞黏附分子和NF-κB 等免疫炎性反應相關性的信號通路（圖2B）。

圖2 差異表達基因的GO和KEGG分析

2.3 CD6與腎臟免疫細胞浸潤相關 使用CIBERSORT 篩選出18 個顯著免疫浸潤樣本的表達矩陣，可見各類T 細胞、B 細胞和巨噬細胞等免疫細胞浸潤,免疫細胞間存在相關性。CD6 與CD8+T 細胞、M1 型巨噬細胞和γδT 細胞呈正相關關系，與幼稚CD4+T 細胞和靜止的NK 細胞呈負相關關系（P＜0.05），見表3。

表3 GSE60861隊列中CD6與免疫細胞的相關性

2.4 UUO 纖維化模型驗證結果 在UUO 小鼠模型中輸尿管結扎的腎臟明顯膨脹，腎皮質被壓迫萎縮（圖3A）；相對Sham組，UUO-7 d組、UUO-14 d組及UUO-21 d 組CD6 mRNA 表達水平升高，其中在UUO-21 d組中表達水平最高（圖3B）。TGF β1在腎小管纖維化的機制中起著核心作用，CD6 mRNA與TGF β1呈正相關關系（r=0.900，P＜0.001，見圖3C）。

圖3 實驗驗證CD6在纖維化模型中表達水平

3 討論

越來越多證據(jù)表明免疫浸潤和炎癥反應在CKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。目前，已有研究篩選了與CKD 腎組織免疫細胞浸潤相關的基因[13-14]，但在免疫相關基因與CKD 進展的相關性研究仍較少。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫的芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了免疫相關性分子CD6是CKD 進展的分子標志物，與免疫細胞浸潤和炎性反應密切相關。腎小管間質萎縮、炎癥浸潤和纖維化是CKD進展的病理性標志。UUO 模型是研究腎小管間質纖維化的經(jīng)典模型[15]，本研究通過構建UUO 小鼠模型，驗證了在纖維化模型中CD6 mRNA的表達水平升高，與TGFβ1 呈正相關關系。本研究發(fā)現(xiàn)CD6 可作為早期識別CKD進展的分子標志物，其可能通過免疫浸潤介導腎小管纖維化影響CKD 發(fā)生發(fā)展，對預防CKD進展提供重要思路。

早在19 世紀80 年代，CD6 被認為淋巴細胞表面受體之一，已知的兩種CD6配體CD166和CD318在免疫細胞和其他各種細胞類型中廣泛表達，包括各種上皮和間充質細胞類型以及許多腫瘤細胞，并參與其生理病理過程[16]。淋巴T細胞和巨噬細胞的活化在腎纖維化中起著重要的角色。研究報道，CD6 過表達可促進T 細胞的增殖和分化為Th1/Th17細胞加速免疫反應[17-18]。在本研究中，在GO功能分析中主要參與淋巴細胞的活化及細胞分子黏附作用，KEEG 主要涉Th1/Th2 和Th17 細胞分化及NF-κB 炎性反應信號通路。另一方面，CIBERSORT 分析發(fā)現(xiàn)CD6 與CD8+T 細胞、M1 型巨噬細胞、γδT細胞呈正相關關系，與幼稚CD4+細胞和靜止的NK細胞呈負相關關系。這與既往研究結果相一致，這在一定程度上說明了CD6可能是通過調節(jié)腎臟局部淋巴T細胞和巨噬細胞等免疫細胞的活化和慢性炎性反應促進CKD進展。

這項研究也存在幾個局限性。首先，本研究用主要用公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行回顧性分析，有必要提供更多前瞻性的臨床試驗來驗證其臨床實用性。其次，CD6影響CKD進展的免疫相關機制是通過基因功能富集預測，尚未通過實驗來驗證。再次，本研究納入對象的疾病亞型是多方面的，本課題組知道不同亞型疾病的發(fā)病機制是不同的，可能存在混雜因素。

綜上，CD6 是CKD 進展的分子標志物，其作用機制可能與免疫細胞的浸潤有關，為改善CKD預后提供了重要線索。目前CKD 免疫功能障礙與病程進展的潛在機制尚未明確，值得進一步研究。