依托咪酯對缺氧復氧誘導心肌細胞炎性損傷及HMGB1/RAGE/NF-κB通路的影響*

潘敏麗，黃國定，盧宏全，蔡冠虎

（海南西部中心醫(yī)院 1.健康體檢科；2.腫瘤內(nèi)科，儋州 571700）

心肌梗塞（myocardial infarction，MI）是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，是人類死亡的一個主要原因，恢復缺血心肌供血是其目前最有效的治療方法，但再灌注會造成心肌炎癥、凋亡等損傷的發(fā)生，嚴重影響患者的治療及恢復[1-2]。其中缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）引發(fā)的炎癥反應是心肌損傷最主要的原因之一，因此闡明炎癥反應發(fā)生機制、有效抑制心肌炎癥反應對治療I/R 心肌損傷至關重要[1]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）的配體，可激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）通路而上調(diào)炎癥反應。HMGB1/RAGE/NF-κB是一個經(jīng)典的炎癥通路，在炎癥激活過程中必不可少，研究發(fā)現(xiàn)阻斷該通路能保護心臟免受I/R 損傷[3]。依托咪酯（etomidate，Eto）作為咪唑類衍生物是一種于臨床中常使用的麻醉誘導劑，可增加肺上皮細胞在I/R中的耐受性，發(fā)揮保護作用[4]。有報道稱，Eto 可抑制膿毒癥小鼠血清HMGB1 水平，減輕小鼠肺部炎癥損傷[5]，但關于其在I/R中的作用還未闡明。因此，本研究通過探討Eto對I/R心肌細胞炎性損傷及HMGB1/RAGE/NF-κB通路的影響，為I/R心肌炎癥損傷的治療機制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

依托咪酯（10 mL∶20 mg，國藥準字H32022999，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；正丁酸鈉（98%，sf5074，上海士鋒生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（GC3110-100 mL，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、H9C2大鼠心肌細胞（SG2592，上海酶研生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（BL10001-020，上海帛龍生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（FY-A014670，上海富雨生物科技有限公司）；白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）（DLR-IL1b-Ra，無錫市東林科技發(fā)展有限責任公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）檢測試劑盒（JW-E10428、JWE10325，上海極威生物科技有限公司）；半胱氨酸蛋白酶3（cysteine aspastic acid-specific protease 3，caspase-3）活性測定試劑盒（GMS50029.1，深圳子科生物科技有限公司）；MTT檢測試劑盒（BJ-R65663，上海邦景實業(yè)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（SS1175，北京欣華綠源科技有限公司）；蛋白提取試劑盒（PE001，南京萊富賽生物科技有限公司）；蘇木精－伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）試劑盒（YPC1275，北京華越洋生物科技有限公司）；兔抗β-actin、HMGB1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3 抗體、Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody（4967、3935、8242、3033、9662、7074，Cell Signaling Technology；RAGE 抗體（GTX23611，GeneTex）；艾森ACEA NovoCyte系列流式細胞儀（北京艾格斯生物科技有限公司）；Glite 965 BW 凝膠成像系統(tǒng)（江蘇偉禾生物科技有限公司）；酶標儀（上海逍鵬生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2 心肌細胞培養(yǎng) 接種H9C2 心肌細胞于DMEM培養(yǎng)基中，放置到37 ℃培養(yǎng)箱中（5%CO2）培養(yǎng)至融合度到90%。

1.2.2 分組和模型構建 隨機將已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞分成對照組、缺氧/復氧（H/R）組（模型組）、Eto-L組（2 mg/L Eto預處理）、Eto-H組（4 mg/L Eto預處理）[6]、正丁酸鈉組（10 mmol/L HMGB1抑制劑正丁酸鈉100 μL）[7]、Eto-H+正丁酸鈉組；H/R心肌細胞模型構建：將細胞接種到已經(jīng)過1 h 純氮氣飽和的無糖DMEM 培養(yǎng)基中，放入含5%CO2及95%N2的培養(yǎng)箱中缺氧7 h，然后接種于高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于含95%空氣+5%CO2的培養(yǎng)箱中復氧2 h[8]。于造模前在Eto-L 組、Eto-H 組、正丁酸鈉組及Eto-H+正丁酸鈉組中分別添加相應藥物處理48 h，而對照組、H/R組細胞常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 檢測炎癥因子水平及LDH 漏出率 收集H9C2 心肌細胞培養(yǎng)上清液，使用TNF-α、IL-6、IL-1β檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中三者的水平，并檢測細胞及培養(yǎng)上清液中LDH 含量，計算LDH 漏出率=上清液LDH含量/（上清液LDH含量+細胞LDH含量）×100%，重復5次。

1.2.4 HE 染色觀察H9C2 細胞形態(tài)學 棄細胞培養(yǎng)液，細胞經(jīng)PBS洗滌后，使用10%甲醛溶液固定，根據(jù)HE 染色試劑盒步驟對細胞進行染色，PBS 洗滌后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.5 MTT法檢測H9C2細胞活力 以5×103個/孔將H9C2 細胞接種于96 孔板中，24 h 后添加5 μg/L MTT（20 μL/孔），于4 h后吸去培養(yǎng)基并添加DMSO（150 μL）震蕩至結晶物溶解，在450 nm處檢測吸光度A450值，細胞存活率（%）=（A處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，重復5孔。

1.2.6 流式細胞術檢測H9C2 細胞凋亡情況 PBS洗滌H9C2 細胞后加入Binding Buffer 重懸，將細胞以5×103個/mL加入100 μL流式管中，依次加入5 μL的Annexin-V-FITC 及10 μL 的PI 后進行避光孵育15 min，上流式儀檢測，重復5次。

1.2.7 caspase-3 活性檢測 繪制標準曲線，收集細胞后加入Caspase Lyais Buffer重懸，冰浴下裂解，根據(jù)caspase-3 檢測試劑盒說明書依次加入各反應試劑孵育1 h后，于405 nm處檢測吸光度，根據(jù)標準曲線計算caspase-3活性=A處理組/A空白對照孔。

1.2.8 Western blotting 檢 測caspase-3 及HMGB1/RAGE/NF-κB 通路蛋白表達 將H9C2 細胞裂解后離心取上清液，使用BCA 試劑盒進行蛋白定量，10%SDS-PAGE 電泳（40 μg/孔）使蛋白質(zhì)分離，轉膜后封閉，添加按1∶1 000 稀釋的兔抗caspase-3、βactin、HMGB1、RAGE、NF-κB p65、p-NF-κB p65 一抗，4 ℃冰箱過夜，添加按1∶5 000 稀釋的山羊抗兔IgG 二抗，孵育1 h 后ECL 發(fā)光試劑顯影，凝膠成像儀曝光觀察，Image J分析p-NF-κB p65、NF-κB p65、β-actin、RAGE、HMGB1 條帶灰度并計算相對表達情況（重復5孔）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用one-way ANOVA 分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Eto 對H9C2 細胞上清液中炎癥因子水平及LDH漏出率的影響

與對照組比較，H/R 組細胞上清液中IL-1β、TNF-α 及IL-6 水平、LDH 漏出率升高（P＜0.05）；與H/R 組比較，Eto-L 組、Eto-H 組、正丁酸鈉組IL-1β、TNF-α 及IL-6 水平、LDH 漏出率降低（P＜0.05）；與Eto-L 組比較，Eto-H 組IL-1β、TNF-α 及IL-6 水平、LDH 漏出率降低（P＜0.05）；與Eto-H 組比較，Eto-H+正丁酸鈉組IL-1β、TNF-α及IL-6水平、LDH漏出率降低（P＜0.05），見表1。

表1 Eto對H9C2細胞上清液中炎癥因子水平及LDH漏出率的影響n=5， ±s

表1 Eto對H9C2細胞上清液中炎癥因子水平及LDH漏出率的影響n=5， ±s

與對照組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05；與Eto-L組比較，cP＜0.05；與Eto-H組比較，dP＜0.05。

2.2 H9C2細胞形態(tài)學觀察

對照組H9C2細胞的形態(tài)、結構均較為正常；H/R組細胞結構異常，細胞壞死現(xiàn)象嚴重；相較于H/R組，Eto-L組、Eto-H組、正丁酸鈉組上述細胞病理癥狀得到不同程度的改善；相較于Eto-H組，Eto-H+正丁酸鈉組改善程度進一步增加，見圖1。

圖1 各組H9C2細胞形態(tài)觀察

2.3 Eto對H9C2細胞活力的影響

與對照組比較，H/R 組H9C2 細胞存活率降低（P＜0.05）；與H/R 組比較，Eto-L 組、Eto-H 組、正丁酸鈉組細胞存活率增高（P＜0.05）；與Eto-L組比較，Eto-H 組細胞存活率增高（P＜0.05）；與Eto-H 組比較，Eto-H+正丁酸鈉組細胞存活率增高（P＜0.05），見表2。

表2 Eto對H9C2細胞活力影響n=5， ±s

表2 Eto對H9C2細胞活力影響n=5， ±s

與對照組比較，aP＜0.05；與H/R組比較，bP＜0.05；Eto-L組比較，cP＜0.05；與Eto-H組比較，dP＜0.05。

2.4 Eto對H9C2細胞凋亡的影響

與對照組比較，H/R組的H9C2細胞早期和晚期凋亡率均增高（P＜0.05）；與H/R 組比較，Eto-L 組、Eto-H 組、正丁酸鈉組細胞早期和晚期凋亡率均降低（P＜0.05）；與Eto-L 組比較，Eto-H 組細胞早期和晚期凋亡率均降低（P＜0.05）；與Eto-H組比較，Eto-H+正丁酸鈉組細胞早期和晚期凋亡率均降低（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 Eto對H9C2細胞凋亡的影響

表3 Eto對H9C2細胞凋亡的影響n=5， ±s

表3 Eto對H9C2細胞凋亡的影響n=5， ±s

與對照組比較，aP＜0.05；與H/R 組比較，bP＜0.05；與Eto-L組比較，cP＜0.05；與Eto-H組比較，dP＜0.05。

2.5 Eto 對H9C2 細胞中caspase-3 活性及蛋白表達的影響

相較于對照組，H/R 組caspase-3 活性與其蛋白表達增加（P＜0.05）；相較于H/R組，Eto-L組、Eto-H組、正丁酸鈉組caspase-3 活性與其蛋白表達降低（P＜0.05）；相較于Eto-L組，Eto-H組caspase-3活性與其蛋白表達降低（P＜0.05）；相較于Eto-H組，Eto-H+正丁酸鈉組caspase-3活性與蛋白表達降低（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 Eto對caspase-3蛋白表達的影響

表4 Eto對H9C2細胞中caspase-3活性的影響n=5， ±s

表4 Eto對H9C2細胞中caspase-3活性的影響n=5， ±s

與對照組比較，aP＜0.05；與H/R 組比較，bP＜0.05；與Eto-L組比較，cP＜0.05；與Eto-H組比較，dP＜0.05。

2.6 Eto 對H9C2 細胞中HMGB1/RAGE/NF-κB 通路蛋白表達的影響

與 對照組比較，H/R 組p-NF-κB p65/NF-κB p65、RAGE、HMGB1表達水平增加（P＜0.05）；與H/R 組比較，Eto-L 組、Eto-H 組、正丁酸鈉組p-NF-κB p65/NF-κB p65、RAGE、HMGB1表達水平降低（P＜0.05）；與Eto-L 組比較，Eto-H 組p-NF-κB p65/NFκB p65、RAGE、HMGB1 表達水平降低（P＜0.05）；與Eto-H 組比較，Eto-H+正丁酸鈉組p-NF-κB p65/NF-κB p65、RAGE、HMGB1 表達水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 Eto對H9C2細胞中HMGB1/RAGE/NF-κB通路蛋白表達的影響

3 討論

MI至今仍是影響人類健康的主要疾病之一，其具有較高的致死性，目前恢復心肌I/R 是其最有效的治療措施，但在該過程中，免疫炎癥細胞釋放IL-1β、TNF-α 及IL-6 等炎癥因子或聚集和浸潤到缺血區(qū)域，通過組織炎癥造成損傷的發(fā)生，因此，炎癥反應是I/R損傷的主要原因之一[1,9-11]。因此，有必要對I/R過程中炎癥發(fā)生、發(fā)展機制及干預方法進行深入探究，以提高MI 患者的治療及恢復效果。本研究通過缺氧復氧構建H/R心肌細胞模型，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H/R 組細胞上清液中IL-1β、TNF-α 及IL-6水平、細胞病理損傷程度增加，表明H/R心肌細胞模型構建成功，H9C2 細胞出現(xiàn)過度的炎癥反應及病理損傷。

麻醉劑的心肌保護作用已在多種動物模型中進行研究，并得到證實，Eto作為臨床中常用的一種麻醉誘導劑，已被證實可防治多種器官的I/R 損傷[12]。文獻報道，Eto可通過減少心肌細胞凋亡及梗死面積來改善兔心肌I/R損傷[12]。Eto也可通過激活核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）通路來改善心功能障礙、纖維化及氧化應激反應來緩解I/R 損傷大鼠心肌損傷[13]。Eto 可通過抑制含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLR family,pyrin domain containing protein 3，NLRP3）/IL-1β 通路激活來降低脂多糖誘導的肝巨噬細胞炎性反應[14]。還有報道稱，Eto可通過促進miR-290-5p表達來緩解脂多糖誘導的心肌H9C2細胞炎癥反應及細胞凋亡[6]。在細胞正常狀態(tài)下，LDH 存在于胞內(nèi)，其會在細胞受到刺激后分泌到胞外，因此LDH漏出率是細胞損傷的重要檢測指標[15]。心肌細胞H/R 后會造成細胞凋亡的發(fā)生，caspase-3 是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行分子，其在細胞H/R 后活性增加[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R 組H9C2 細胞上清液中LDH 漏出率、凋亡率、caspase-3活性及其蛋白表達水平增加，而細胞存活率降低，表明缺氧復氧可對H9C2 細胞造成損傷，促進細胞凋亡。而Eto則可降低H9C2細胞炎癥因子分泌，改善細胞病理損傷，抑制細胞凋亡率，與前人研究結果相似[6]。研究結果表明，Eto可有效抑制炎癥反應及細胞凋亡，改善心肌細胞I/R損傷，其有作為心肌I/R損傷防治藥物的潛能。

HMGB1作為一個廣泛存在于哺乳動物細胞中高度保守的核蛋白，當機體受損時會從胞核轉移至細胞質(zhì)中與RAGE及TLR-4相結合，激活NF-κB，從而介導IL-1β、TNF-α 等細胞因子的釋放，產(chǎn)生炎癥反應[17-18]。大量證據(jù)表明，心肌I/R過程中的炎癥反應的發(fā)生與HMGB1密切相關，有報道稱，缺血壞死的心肌細胞可將HMGB1 釋放到血液中，激活脾臟白細胞，在再灌注過程中引發(fā)炎癥反應[3,19]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1/RAGE/NF-κB通路在心肌I/R損傷中被激活，苦味苷Ⅱ可通過抑制該通路來抑制炎癥反應，以此對心肌損傷起到保護作用[18]。Eto可通過抑制I/R大鼠氧化應激及NF-κB磷酸化來保護心肌損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復氧后H9C2細胞內(nèi)p-NFκB p65/NF-κB p65、RAGE、HMGB1 表達增加，這表明HMGB1/RAGE/NF-κB 通路參與心肌I/R 損傷的病理過程；而Eto能降低細胞內(nèi)HMGB1/RAGE/NFκB 通路相關蛋白表達，結果表明，Eto 對H/R 后H9C2 細胞的HMGB1/RAGE/NF-κB 通路具有抑制作用，其可能通過抑制該通路實現(xiàn)對H/R 后H9C2細胞損傷的改善。為驗證這一猜測，本研究使用HMGB1 抑制劑正丁酸鈉處理細胞，發(fā)現(xiàn)正丁酸鈉具有與Eto相同的作用，可改善H/R后細胞損傷，并且，其可進一步增加Eto對心肌細胞炎癥、凋亡的改善作用，結果表明，Eto 對H/R 后H9C2 細胞炎癥及凋亡的改善可能與其抑制HMGB1/RAGE/NF-κB通路有關。

綜上所述，Eto 可能通過抑制HMGB1/RAGE/NF-κB 通路來降低炎癥因子釋放，從而抑制H/R 心肌細胞損傷，其有可能作為心肌I/R 損傷防治藥物。本研究不僅為心肌I/R損傷治療機制研究提供一定參考，還為其防治藥物的探究提供依據(jù)。