松材線蟲侵染前后馬尾松樹體內微生物多樣性分析

溫曉健，巫建軍，李永先，王 璇，理永霞＊，張星耀

(1.中國林業科學研究院森林生態環境與自然保護研究所 國家林業和草原局森林保護學重點實驗室，北京 100091；2.浙江省遂昌縣生態林業發展中心，浙江 遂昌 323399)

植物體內含有多種微生物，其中許多微生物與植物之間的相互作用對植物的生存、適應性和生態系統功能等方面都有有益的影響[1-2]，大量研究表明內生菌在提高植物免疫防御[3]、病害控制[4]、營養獲取[5]和植物對非生物脅迫的耐受方面[6]有明顯的促進作用。比如Wu 等人[7]從野生藍莓的內生菌中分離到一株深色有隔真菌，將該菌接種到藍莓上可促進其根部生長和分枝，Carro-Huerga 等人[8]從葡萄樹體里分離到一株木霉，該菌可減少葡萄上病原菌的定殖從而限制病害的發展。

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是全球森林生態系統中最具危險性、毀滅性的有害生物之一，具有極強的擴散性和破壞性，自1982 年入侵我國后，先后在亞熱帶、熱帶、暖溫帶、中溫帶以及秦嶺等高海拔地區造成松林大面積枯死[9]，造成了巨大的經濟和生態損失，而且疫區仍在不斷增加。松材線蟲侵入寄主后，首先取食松樹的薄壁細胞，當松樹死亡后，開始取食樹體內的真菌，使得其種群得以維持和擴大[10]；松樹內生微生物群落具有提高樹木防御能力的潛力，但也可能隨著病害的發展而轉換角色，最終導致樹木腐爛[11]。由此可見，松樹內生微生物在松材線蟲病的發展過程中發揮重要作用。充分了解松樹體內微生物的群落結構有助于了解松材線蟲病的發病過程，也為認識寄主和微生物的共生關系以及微生物資源的開發利用提供參考和科學依據。

許多研究結果表明松材線蟲入侵對寄主松樹的內生微生物群落多樣性具有重要影響，而且松樹的許多內生菌也具有很大的生防潛力。曾凡勇等[12]對不同健康狀態黑松（Pinus thunbergiiParl.）樹干內真菌進行了分離，發現不同健康狀態下真菌種群沒有顯著差異，但是優勢真菌及其比率不同。魯國華[13]分析了不同健康狀態馬尾松（P.massonianaLamb.）和黑松樹干內真菌的種類變化，認為松材線蟲病影響了寄主松樹真菌種群的變化。徐風美[14]通過對松材線蟲病發生區和未發生區油松（P.tabuliformisCarr.）根部真菌進行分離和鑒定，發現根部外生菌根真菌和深色有隔內生真菌的相對豐度不同，這可能與松樹對松材線蟲病的抗性有關。Ma 等人[15]利用高通量測序技術研究了松材線蟲侵染前后黑松不同部位的細菌群落結構，發現健康樹和受害樹針葉和根部細菌的群落結構不同，表明松材線蟲可以影響寄主的細菌群落結構。Ponpandian等人[16]從赤松（P.densifloraSieb.et Zucc.）、剛松（P.rigidaMill.）、黑松和紅松（P.koraiensisSieb.et Zucc.）不同組織部位中分離得到1 622 株內生細菌，從中篩選到44 株具有殺線活性的細菌，其中窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌的殺線作用最突出。Kim 等人[17]從分離到的92 株松樹內生細菌中篩選出3 株可誘導松樹產生抗性的細菌，通過葉面噴灑這3 株細菌的菌懸液均可顯著降低松材線蟲病的發病程度。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019 年9 月在浙 江省富陽區（30°3′N,119°58′E）和淳安縣（29°36′N,118°58′E）采集健康馬尾松和由松材線蟲侵染引起的枯死馬尾松各4 棵，枯死馬尾松均為當年枯死樹，經貝爾曼漏斗法分離后每克木材中松材線蟲數量大于100 頭，健康馬尾松中沒有分離到松材線蟲，枯死樹中均分離到松材線蟲，其中3 棵健康馬尾松和2 棵枯死馬尾松來自富陽區，1 棵健康馬尾松和2 棵枯死馬尾松來自淳安縣。所采集的馬尾松均為25～30 年生，胸徑為17～22 cm，樹高為16～20 m。分別采集馬尾松地下部分10 cm 深處的側根、地上部分主干的上、中、下3 段和2 年生針葉，編號后封存于保鮮袋。

1.2 試劑和引物

植物基因組DNA 提取試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒、2 × Taq PCR MasterMix，D2000 DNA Marker 購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 引物對ITS1/ITS4 和27F/1492R 由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 樣品處理

采用常規組織分離法分離馬尾松不同部位的真菌和細菌。側根處理前先將根表面的土用無菌水沖洗掉，再用滅菌濾紙擦干后備用。主干處理前先將粗糙的表皮刮掉。所有樣品用75% 的乙醇浸泡1 分鐘后用無菌水沖洗3 次，取最后1 次的沖洗液涂布于PDA 培養基（200 g 去皮馬鈴薯，20 g 葡萄糖，15 g 瓊脂粉，去離子水1000 mL）和牛肉膏蛋白胨培養基（NA）（蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉浸出粉3 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL）平板做表面消毒效果檢測。用無菌濾紙擦干組織表面的水分，用無菌枝剪剪去主干和根經酒精處理過的表面組織，再將剩余的主干和根剪碎成約3 mm ×3 mm × 2 mm 的木塊，將針葉剪成約6 mm 長的片段，用于后續分離。

1.4 微生物的分離

1.4.1 真菌 用無菌鑷子將剪碎的組織塊置于90 mm 的PDA 培養基上，每個樣品接種25 個組織塊，健康和枯死馬尾松各4 棵，根、干和針葉各200 塊，共600 個組織塊，置于25℃培養箱中黑暗培養，待其長出菌落后用無菌接種針挑取菌落邊緣氣生菌絲置于PDA 培養基上純化培養。將菌落特征相同的菌株進行歸類統計，將分離純化后的不同菌落形態的菌株接種于PDA 培養基上，并對菌株進行編號，保存備用。

1.4.2 細菌 用無菌鑷子夾取1 g 剪碎的組織塊，置于5 mL 的無菌水中，28℃，200 r· min-1振蕩培養1 h，混勻，吸取100 μL 培養液涂布于NA 培養基上，28℃培養24 h，挑取單菌落至NA 培養基上純化，挑取純化后的細菌單菌落至牛肉膏蛋白胨液體培養基（NB）（蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉浸出粉3 g，去離子水1 000 mL）中，28 ℃，200 r· min-1培養24 h，4℃保存備用。

1.5 微生物的鑒定

1.5.1 DNA 提取 將1.4.1 保存的菌株重新接種于PDA 培養基，25℃培養7 d，挑取菌絲于2 mL離心管中，采用植物基因組DNA 提取試劑盒（DP320）提取菌株DNA。對于菌液PCR 無條帶的細菌菌株進行DNA 提取。取1.4.2 中細菌菌液1 mL 于1.5 mL 離心管 中，6 000 r· min-1離 心1 min，棄去上清液，采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）提取菌株的總DNA。

1.5.2 PCR 擴增 采用真菌核糖體rDNA 區通用引物ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR 反應體系25 μL 包含：基因組DNA 1 μL，2 × Taq PCR MasterMix（KT201）12.5 μL，引物ITS1 0.5 μL，引物ITS4 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個循環；72℃延伸10 min。

(1)子曰：下之事上也，不從其所命，而從其所行，上好[此物也，下必有甚焉者矣。故]上之好惡，不可不慎也，民之表也。(《緇衣》)

采用細菌16S rDNA 區通用引物27F/1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-TACGG TTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR 擴增。利用4℃保存的菌液或基因組DNA 作為PCR 模板，PCR 反應體系50 μL 包含：菌液或基因組DNA2 μL，2 × Taq PCR MasterMix（KT201）25 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，ddH2O 21 μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35 個循環；72℃延伸10 min。

1.5.3 基因序列測序及比對 取5 μL PCR 產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將剩余的PCR 產物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，對拼接后的序列利用BLAST 軟件進行序列相似性比對。結合本研究分離到的木霉菌株，選取部分代表菌株的ITS 序列，利用MEGA 6.0 軟件的鄰接法構建系統發育進化樹，自展值（Bootstrap replications）為1 000 次。

1.6 取食木霉（Trichoderma spp.）對松材線蟲種群數量的影響

將本研究分離到的6 種木霉屬（Trichoderma）真菌分別接種至PDA 平板上，于25℃恒溫培養7 d。將實驗室保存的松材線蟲蟲株Nxy61 接至培養7 d 的灰葡萄孢平板并置于25℃恒溫培養，7 d 后用無菌水將松材線蟲從平板洗下，用無菌水重復換洗3 遍后計數。分別吸取約3 000 條松材線蟲接種于培養7 的木霉和灰葡萄孢（Botrytis cinereaPers.）平板上，于25℃恒溫培養7 d，7 d 后用無菌水完全沖洗平板，通過光學顯微鏡統計活體松材線蟲的種群數量。每個處理5 個重復，以灰葡萄孢培養松材線蟲作為對照。

1.7 統計分析

采用分離率和分離頻率分析馬尾松不同部位分離的真菌豐富程度及優勢菌群，采用Shannon-Wiener 指數(H)、Simpson 指數(D)、均勻度指數(J)分析分離真菌的多樣性特征，用Sorenson 指數(Cs)和Jaccard 指數(Cj) 分析不同組織和不同健康狀態馬尾松的真菌種類組成的相似程度[18]。

式中：Pi為第i種的個體數占總物種數S的比例。

j為兩個組織或樣本共有的真菌種數，a和b分別為每個組織或樣本中的真菌種數。

利用SPSS 22.0 對松材線蟲取食不同真菌后的種群數量進行單因素方差分析及Duncan’s 多重比較（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 馬尾松不同組織的微生物組成

2.1.1 馬尾松不同組織內的真菌組成 對浙江馬尾松進行內生真菌分離，經純化后分離得到健康馬尾松內的真菌106 株，其中干部的分離率最高，為55%（55 株），其次為針葉和根部，分離率分別為46%（46 株）和5%（5 株）。經過ITS 序列比對將分離菌株劃分為19 個屬，木霉屬（Trichoderma）為優勢類群，占菌株總數的25.47%，而且不同部位的優勢類群不同，根部優勢屬為毛色二孢屬（Lasiodiolodia），干部為木霉屬（Trichoderma），針葉為擬盾殼霉屬（Paraconiothyrium）（表1）。枯死馬尾松中分離得到真菌86 株，其中針葉的分離率最高，為44%（44 株），其次是干部和根部，分離率分別為32%（32 株）和10%（10 株）。經過ITS 序列比對將分離菌株劃分為10 個屬，木霉屬（Trichoderma）也為優勢類群，占菌株總數的34.88%，分不同部位來看，根部和干部的優勢屬為木霉屬（Trichoderma），針葉為散斑殼屬（Lophodermium）（表2）。

2.1.2 馬尾松不同組織內的細菌組成 對浙江馬尾松進行內生細菌的分離，經純化后分離得到健康馬尾松內的細菌59 株，經過序列比對將分離菌株劃分為13 個屬，其中伯克氏菌屬（Burkholderia）18 株為優勢菌群，占分離細菌總數的30.51%；沙雷氏菌屬（Serratia）和腸桿菌屬（Enterobacter）各10 株，占16.95%；泛菌屬（Pantoea）4 株，占6.78%；其它細菌占28.81%。根據不同部位的分離情況，根部、干部和針葉的優勢菌群分別是伯克氏菌屬（Burkholderia）、腸桿菌屬（Enterobacter）和沙雷氏菌屬（Serratia）（表3）。從枯死馬尾松中分離得到細菌56 株，經過序列比對將分離菌株劃分為12 個屬，其中伯克氏菌屬（Burkholderia）22 株為優勢菌群，占分離細菌總數的39.29%；腸桿菌屬（Enterobacter）8 株，占14.29%；沙雷氏菌屬（Serratia）6 株，占10.71%；芽孢桿菌屬（Bacillus）5 株，占8.93%；其它細菌占26.78%。根據不同部位的分離情況，根部和干部的優勢菌群分別是伯克氏菌屬（Burkholderia）和腸桿菌屬（Enterobacter）（表4）。

2.2 馬尾松樹體內真菌分布多樣性及相似性

由表1 可知，健康馬尾松不同組織間的真菌分布存在較大差異，干部分離到的真菌有13 個屬，種類最多，Shannon-Wiener 指數（H）為1.81，針葉分離的真菌有8 個屬，H為1.68，根部分離的真菌只有2 個屬，H為0.50。Simpson 指數（D）以干部最高，為0.78，根部最低，為0.32；均勻度指數（J）以干部最高，為0.45，根部最低，為0.31。與健康馬尾松相比，枯死馬尾松不同組織分離到的真菌種類較少，干部和針葉都分離到5 個屬的真菌，H分別為0.99 和1.09。Simpson 指數（D）以針葉最高，為0.56，根部最低，為0.32；干部和針葉的均勻度指數（J）相同，為0.29，根部最低，為0.22（表2）。

從表5 可看出，健康和枯死馬尾松根葉的相似性均為0，健康馬尾松干葉的相似性最高，枯死馬尾松根干的相似性最高，但指數值均小于0.5，表明健康和枯死馬尾松不同組織間的真菌菌群相似性都較低。

表5 健康和枯死馬尾松不同部位真菌菌群相似性系數Table 5 The similarity indexes of fungal community of different tissue from healthy and dead Masson pine

由表1 和表2 可知，健康馬尾松的真菌多樣性高于枯死馬尾松，Shannon-Wiener 指數（H）、Simpson 指數（D）和均勻度指數（J）依次為2.37、0.87 和0.51，均高于枯死馬尾松的1.72、0.76 和0.39。從相似性指數來看，健康和枯死馬尾松的真菌菌群之間相似性較低，Sorenson 指數(CS)和Jaccard 指數(Cj)分別為0.48 和0.32，均小于0.5。

表1 健康馬尾松不同部位內生真菌的組成及分離頻率Table 1 The fungal composition and isolation frequency of different tissues in healthy Masson pine

表2 枯死馬尾松不同部位內生真菌的組成及分離頻率Table 2 The fungal composition and isolation frequency of different tissues in dead Masson pine

2.3 馬尾松樹體內細菌分布多樣性及相似性

由表3 可知，健康馬尾松不同組織間的細菌分布存在較大差異，干部分離到11 個屬（32 株）的細菌，種類最多，其次是根部的5 個屬（21 株），最少的是針葉（4 株），只分離到3 個屬的細菌。在枯死馬尾松中，也是干部分離到的細菌種類最多，有10 個屬（27 株），根部和針葉分別分離到3 個屬（24 株）和2 個屬（4 株）的細菌（表4）。健康和枯死馬尾松中均為干部的細菌多樣性最高，針葉的細菌多樣性最低。

表3 健康馬尾松不同部位內生細菌的組成及分離頻率Table 3 The bacterial composition and isolation frequency of different tissues in healthy Masson pine

表4 枯死馬尾松不同部位內生細菌的組成及分離頻率Table 4 The bacterial composition and isolation frequency of different tissues in dead Masson pine

健康和枯死馬尾松中共有的細菌種類有8 個屬，其中干部共有的類群有8 個屬，根部有2 個，針葉有1 個，Sorenson 指數(CS) 和Jaccard 指數(Cj)分別為0.70 和0.53，表明健康和枯死馬尾松的細菌群落具有一定的相似性。

2.4 木霉屬真菌的系統發育分析

本研究共分離到6 種木霉，在6 cm 培養皿內的PDA 培養基上培養4 d 后菌落形態見圖1。以Protocrea farinosa為外族群，6 種木霉的系統發育進化樹結果見圖2。6 個種類的木霉在發育樹中歸于3 個進化支，FXY7 與T.harzianum親緣關系最近，FXY8 與T.spirale親緣關系最近，FXY37 歸于longibrachiatum 分支，FXY19、FXY32 和FXY56這3 種木霉歸于同一分支。

圖1 6 種木霉的菌落形態Fig.1 Colony morphology of six Trichoderma species

圖2 基于ITS 序列構建的木霉系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Trichoderma strains inferred from ITS gene sequences

2.5 取食木霉對松材線蟲種群數量的影響

由圖3 可知，不同木霉培養下的松材線蟲種群數量具有顯著差異，取食木霉FXY8 的松材線蟲數量最多，達到162 300 條，顯著高于灰葡萄孢培養的松材線蟲數量，取食木霉FXY7 的松材線蟲數量最少，只有4 275 條，最不利于松材線蟲繁殖（F=6.21，df=6,28，p＜0.05）。其它4 種木霉的培養效果與灰葡萄孢沒有顯著差異，但用FXY19 培養得到的線蟲數量明顯多于FXY56。

圖3 取食不同真菌后活體松材線蟲的種群數量Fig.3 Populationquantity of live pine wood nematodes fed on different fungi

3 討論

本研究從浙江健康和枯死馬尾松中共分離出隸屬于22 個屬的192 株真菌和16 個屬的105 株細菌，健康和枯死馬尾松真菌菌群之間的相似性較低，不同部位的優勢菌群不同，但優勢類群均為木霉屬真菌（表1 和表2），而健康和枯死馬尾松細菌菌群之間的相似性較高，優勢菌群均為伯克氏菌屬、沙雷氏菌和腸桿菌屬，而且不同部位的優勢類群也較為一致（表3 和表4）。從物種多樣性來看，健康馬尾松的真菌和細菌多樣性都高于枯死馬尾松，尤其是真菌，這表明由于松材線蟲的侵染，降低了馬尾松內生真菌的多樣性。Zhang 等人[19]利用高通量測序技術對浙江健康和枯死馬尾松的內生真菌和細菌群落結構進行分析，發現健康馬尾松中優勢真菌為青霉屬、擬盤多毛孢屬和木霉屬真菌，在枯死馬尾松中這三類真菌的豐度有所下降，而優勢細菌在健康和枯死馬尾松中的分布較為一致。他們還發現枯死馬尾松的內生細菌和真菌的豐富度和多樣性都低于健康馬尾松，尤其是真菌，這與我們的分離結果也是一致的，表明我們的分離結果可以反映浙江健康和枯死馬尾松內生真菌和細菌的菌群結構。

曾凡勇[20]對浙江健康、衰弱和枯死馬尾松樹干的內生真菌進行了分離，木霉均為優勢菌，且衰弱木中分離到的真菌數量最多，枯死木中最少。肖育貴等[21]分析了四川不同健康狀態馬尾松樹干木居真菌的種類，分離出的真菌種類主要有木霉屬、鐮刀菌屬和多毛孢屬等，健康木分離到的真菌數量最少。魯國華等[22]對安徽省不同健康狀態馬尾松樹干內的真菌種類進行了研究，發現健康馬尾松樹干的優勢真菌為鐮刀菌和木霉，瀕死馬尾松和死亡馬尾松均為長喙殼和木霉，健康馬尾松上分離到的真菌數量最少。本研究中對樹干的真菌分離結果顯示健康木的真菌種類和數量均高于枯死馬尾松，這可能與采集枯死馬尾松的時間和狀態有關，樹木的腐爛程度會影響樹體內真菌的群落結構[23-24]。鄧慧華[25]對福建省健康馬尾松不同組織的內生真菌進行了分離，葉部分離到的內生真菌數量和種類最多，莖部次之，根部最少，毛霉屬和木霉屬是馬尾松內生真菌中的優勢屬。結合本研究和前人的分離結果可知，木霉屬是馬尾松體內的優勢真菌。

松樹體內的真菌種群與松材線蟲病的發生和發展密切相關。呂全等[26]研究了3 個馬尾松樹棲真菌菌株對媒介昆蟲攜帶松材線蟲數量的影響，發現不適宜松材線蟲繁殖的真菌能促進松材線蟲群體內更多個體轉化為擴散型蟲態，不同真菌對蛹室中線蟲種群大小有顯著影響。Maehara 和Futai[27]發現在只接種Trichodermasp.的木段上天牛攜帶的線蟲數量很少，另外在木段上接種Trichodermasp.3 可以抑制藍變菌的擴散，從而減少天牛攜帶的線蟲數量[28-29]，由此可見，木霉對松材線蟲種群的擴散也有一定的抑制作用。本研究中共分離到6 種木霉，通過取食實驗可知，FXY7 顯著抑制了松材線蟲的種群數量。木霉屬真菌是一類高效的拮抗、促生菌，對松材線蟲也具有一定的致死作用。鉤狀木霉Trichoderma hamatum孢子懸浮液對松材線蟲毒性較強，致死率可以達到85.6%[30]。木霉菌株T-28 的乙酸乙酯提取物在72 h 校正死亡率達到100%[31]。木霉的揮發性化合物對松材線蟲也具有一定的殺蟲活性[32-33]。本研究分離到的木霉對松材線蟲病是否具有其它生防作用還需進一步展開研究。

關于馬尾松內生細菌群落結構的研究較少，袁文婷對健康馬尾松莖部的內生細菌進行了分離，共分離到20 株細菌，通過內生性驗證后對其中7 個菌株進行了種類鑒定，并未對群落結構進行描述。尹詩恒等[34]研究了松材線蟲侵染下馬尾松苗不同部位內生細菌菌群的結構變化，發現松干部位菌群結構變化極顯著，其次是松針，根部基本不受影響。前人也從馬尾松體內分離出一些具有生防作用的內生細菌，李亮亮等[35]從馬尾松莖部分離到一株松材線蟲拮抗細菌短小芽孢桿菌，并通過熒光標記法證明了該菌株在馬尾松體內的內生性，為該菌今后的實際應用提供了理論依據。Song 等人[36]從馬尾松頂芽和針葉中分離到一株Pantoea eucalypti，根據其基因組特征和攜帶質粒的功能推測該菌可促進松樹生長。沙雷氏菌屬細菌也是馬尾松中經常分離到的一類細菌，從蛹室分離到的Serratia marcescens可以促進松褐天牛的死亡[37]。本研究中分離到多株沙雷氏菌屬和芽孢桿菌屬細菌，這些菌株對松材線蟲病的控制作用還有待進一步研究。

4 結論

健康馬尾松樹體內的真菌多樣性高于枯死馬尾松，二者真菌菌群相似性較低，而且不同組織間真菌菌群相似性也較低；對于細菌來說，健康和枯死馬尾松的細菌群落具有一定的相似性。這表明松材線蟲入侵會影響馬尾松樹體內的真菌多樣性，但對細菌的影響較小。另外本研究中分離到多株可能對松材線蟲病具有生防潛力的內生菌，為探索松材線蟲病的新型防控技術奠定了基礎。