基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討丹參飲治療擴張型心肌病的作用機制

何軒輝，陳恒文，譚雨晴，2

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)主要特征是左心室或雙心室擴張和收縮功能受損，且不同于異常負荷狀態(tài)(如高血壓和瓣膜性心臟病)或冠狀動脈疾病[1]。擴張型心肌病病因復(fù)雜，可大致分為遺傳型和非遺傳型，遺傳型的涉及編碼細胞骨架、肌節(jié)等基因突變；非遺傳型包括感染引起的心肌炎、不良接觸(如藥物、酒精、毒素)以及代謝、免疫、內(nèi)分泌紊亂等[2]。擴張型心肌病常導(dǎo)致充血性心力衰竭，但也可能出現(xiàn)循環(huán)衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死[2-3]。擴張型心肌病臨床治療主要以改善心功能、減輕癥狀為主，應(yīng)該針對根本原因?qū)嵤﹤€體化治療，恢復(fù)心功能，逆轉(zhuǎn)心肌重塑[4]。中西醫(yī)病證結(jié)合治療擴張型心肌病，可以增強心肌收縮功能，提高射血分數(shù)，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，且可提高病人生活質(zhì)量，改善預(yù)后[5]。中醫(yī)認為，心陽不足、氣陰虧虛與痰、濕、寒、瘀等交互作用，從而出現(xiàn)胸悶胸痛、心煩氣短、咳嗽氣促等癥狀，與《靈樞》《素問》《備急千金藥方》等所記載的“心脹”“心痹”相似。《黃帝內(nèi)經(jīng)》言：“人之所有者，血與氣耳”，運用中醫(yī)藥治療擴張型心肌病也應(yīng)氣血同調(diào)。

丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，原方廣泛運用于治療氣滯血瘀的心胃痛諸癥[6]。有研究結(jié)果顯示，治療擴張型心肌病的中藥方中，丹參飲使用頻率較高[7]。臨床多用降香代檀香，丹參倍用，為君藥，《本草綱目》記載丹參有活血之功效，可通心包絡(luò)，亦補亦瀉，氣行則血行，氣滯則血瘀，故配伍降香和砂仁，降香入氣分，辛香走竄，溫通行滯，又入血分，可散瘀止痛，善通血脈。《雷公炮制藥性解》記載砂仁可主腹痛、心疼，咳嗽喘滿。辛、溫之性味善于行氣和胃化濕，補中伏土，正所謂“溫升其肝脾，清降其肺胃”。三味藥物配伍相宜，氣血同調(diào)，攻補兼施，可行氣滯、通血瘀、止定痛。

中醫(yī)藥治療擴張型心肌病優(yōu)勢顯著、療效穩(wěn)定、安全耐受，在改善心臟收縮舒張功能及逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等方面具有巨大的潛能，然而其發(fā)揮心血管保護作用的藥物成分、干預(yù)靶點、作用途徑不甚明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以基于多學(xué)科交叉整合關(guān)聯(lián)藥物-成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)機制，本研究采用這一方法從不同層面、多個靶點、多種途徑分析丹參飲干預(yù)擴張型心肌病的潛在機制，為臨床研究及機制研究提供依據(jù)，為后續(xù)中醫(yī)藥治療擴張型心肌病的經(jīng)典傳承、機制研究、新藥研發(fā)、靶向化治療提供思路及理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 丹參飲主要活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)查找丹參飲中三味藥物的化學(xué)成分，臨床檀香多用降香代替，故檢索丹參、降香、砂仁，根據(jù)毒藥動力學(xué)(ADME)值中的口服利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18篩選獲得藥物主要活性成分，結(jié)合中藥藥典進行補充，并利用TCMSP獲取化合物的靶點信息，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對化合物靶點信息進行規(guī)范化處理。

1.2 擴張型心肌病靶點篩選 查找GeneCards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫中與疾病相關(guān)的靶點，設(shè)定檢索詞為“dilated cardiomyopathy”，GeneCards數(shù)據(jù)庫中relevance score參數(shù)值表述靶點與疾病相關(guān)度，數(shù)值與相關(guān)度成正比，根據(jù)相關(guān)度篩選，合并兩個數(shù)據(jù)庫的疾病靶點信息，保留唯一值建立擴張型心肌病疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 丹參飲-擴張型心肌病靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 合并丹參飲活性成分對應(yīng)靶點數(shù)據(jù)庫以及擴張型心肌病疾病靶點數(shù)據(jù)庫，映射組建丹參飲-擴張型心肌病靶蛋白，采用Cytoscape 3.7.2軟件，將化合物與潛在靶點的關(guān)系對應(yīng)關(guān)聯(lián)，形成“藥物有效成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。將靶蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫，完成篩選，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，最小互作閾值設(shè)定為中等置信度(medium confidence)，游離點無須隱藏，分析網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，確定蛋白互作關(guān)系中的關(guān)鍵點。

1.4 丹參飲-擴張型心肌病功能和通路富集分析 將丹參飲與擴張型心肌病的交集靶點導(dǎo)入DAVID 6.8平臺，以P值條件篩選，對其進行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，通過潛在作用靶點參與的生物學(xué)途徑，分析丹參飲發(fā)揮藥理作用的主要信號通路及生物過程，探討其治療擴張型心肌病可能的作用機制。

2 結(jié) 果

2.1 丹參飲主要活性成分 初步篩查TCMSP中丹參飲中3味藥物的化學(xué)成分，結(jié)合中藥藥典中對這3味中藥主要成分的描述進行補充，增加了丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、乙酸龍腦酯3個成分，其中丹參相關(guān)的活性成分67個、降香相關(guān)的活性成分37個、砂仁相關(guān)的活性成分11個，刪除重復(fù)項后，共得112個化合物，詳見圖1。其中，poriferast-5-en-3beta-ol是丹參和砂仁共有的化合物， beta-sitosterol是降香和砂仁共有的化合物，OB最高的兩種化合物為przewalskinb、(2R)-3-(3， 4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid；DL最高的2種成分為stigmasta-5，22-dien-3-beta-yl acetate、sitosteryl acetate。丹參飲部分化合物信息見表1。

圖1 丹參飲主要成分韋恩圖

表1 丹參飲部分成分基本信息

(續(xù)表)

2.2 丹參飲藥物-主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 采用TCMSP獲取活性成分相關(guān)靶點，UniProt數(shù)據(jù)庫限定物種為“人”，校正靶點，得到丹參相關(guān)成分靶點130個，降香相關(guān)成分靶點71個、砂仁相關(guān)成分靶點50個，去除重復(fù)值后獲得丹參飲藥物靶點151個。采用Cytoscape 3.7.2繪制藥物-主要活性成分-靶點圖，有266個節(jié)點，1 490條邊，不同藥物可以有相同的成分，不同成分對應(yīng)的靶點構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)機制錯綜復(fù)雜，一般對應(yīng)多個靶點，圖中活性成分取MOD ID后5位數(shù)字表示。詳見圖2。

圖2 丹參飲藥物-主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 丹參飲治療擴張型心肌病潛在靶點預(yù)測 在GeneCards檢索擴張型心肌病相關(guān)的基因，根據(jù)Relevance score值篩選大于10，獲取722個候選基因，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得222個候選基因，將兩個數(shù)據(jù)庫獲取的疾病靶點取并集，保存唯一值，最終獲得891個疾病潛在靶點。與TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的活性成分相關(guān)靶點取交集，最終共同靶基因有44個，詳見圖3。利用Cytoscape 3.7.2對丹參飲活性成分治療擴張型心肌病作用靶點的關(guān)系繪制網(wǎng)絡(luò)圖，涉及73個活性成分和345條邊，節(jié)點度值(Degree)表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，圖形面積與度值成正比，結(jié)果顯示：鈉通道蛋白5型亞基α(SCN5A)、β2 -腎上腺素能受體(ADRB2)、雌激素受體(ESR1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2(CHRM2)、腎上腺素受體α1D (ADRA1D)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)等靶點在網(wǎng)絡(luò)中較重要。詳見圖4。

圖3 丹參飲有效成分作用靶點及擴張型心肌病靶點交集韋恩圖

圖4 丹參飲有效成分治療擴張型心肌病作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 丹參飲有效成分-擴張型心肌病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 獲取丹參飲和擴張型心肌病交集靶點44個，利用STRING 數(shù)據(jù)庫分析交集靶點，構(gòu)建丹參飲潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有42個靶點發(fā)生相互作用，2個孤立的靶點，有447條邊，平均度值為21.286，度值大于平均值的靶點蛋白有27個，排名較為靠前的為內(nèi)皮素1(EDN1)、白介素6(IL6)、血管內(nèi)皮生長因子 A(VEGFA)、低聚果糖(FOS)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生長因子受體(EGFR)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白介素10(IL10)、NOS3，提示這些靶點蛋白可能在丹參飲治療擴張型心肌病的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。詳見圖5。

圖5 丹參飲有效成分-擴張型心肌病交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 丹參飲GO功能與KEGG通路富集分析 將丹參飲有效成分靶點與擴張型心肌病疾病靶點的交集輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能以及通路分析，以P<0.01進行篩選，獲得生物學(xué)過程137項條目、細胞組分13項條目、分子功能22項條目，丹參飲主要涉及的細胞組分主要涉及質(zhì)膜、細胞外間隙、胞外區(qū)等(見圖6)；生物學(xué)過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控等(見圖7)；丹參飲調(diào)節(jié)擴張型心肌病的分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞因子活性、蛋白質(zhì)異二聚化活性等(見圖8)。根據(jù)P<0.05篩選KEGG通路，得到77條通路信息，以基因數(shù)目降序，取前20位通路進行分析，結(jié)果見圖9，顯示丹參飲干預(yù)擴張型心肌病靶點基因主要富集于低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、TNF信號通路、 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-磷酸激酶B(Akt)信號通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)、T細胞受體信號傳導(dǎo)途徑、鈣信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號通路等。以P值取負對數(shù)，以顏色深淺表示顯著性，富集基因數(shù)目與氣泡面積成正比。

圖6 丹參飲主要成分潛在靶點的細胞組成富集分析(前10位)

圖7 丹參飲主要成分潛在靶點的關(guān)鍵生物過程富集分析

圖8 丹參飲主要成分潛在靶點的分子功能富集分析

圖9 丹參飲治療擴張型心肌病的KEGG通路富集分析(前20位)

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，借助多個數(shù)據(jù)庫、軟件分析平臺，建立了丹參飲-有效成分-作用靶點-擴張型心肌病網(wǎng)絡(luò)模型，初步篩選后獲得丹參飲有效成分112個，藥物靶點151個，對丹參飲有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)簡要分析發(fā)現(xiàn)，藥物成分多樣，不同藥物成分可能有交叉，成分相對應(yīng)的靶點也有不同。β-谷甾醇、木犀草素、丹參酮ⅡA、維斯體素、柚皮素等成分在網(wǎng)絡(luò)圖中聯(lián)系密切，占據(jù)重要位置，可能是丹參飲治療擴張型心肌病的潛在有效成分。研究表明，β-谷甾醇是一種天然的抗氧化劑，對氧化應(yīng)激損傷具有保護作用[8]，可以促進線粒體產(chǎn)生活性氧生成三磷酸腺苷(ATP)，保護心肌[9]，增強阿司匹林的抗炎作用，且具有調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)功能[10-11]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化[12]、抗病毒[13]等藥理特性，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子[如STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[14]]，抑制白介素-8的產(chǎn)生，環(huán)氧合酶-2(COX-2)及NOS2的表達和一氧化氮(NO)的過度生成[15]，其利尿排鈉作用可能與毒蕈堿型乙酰膽堿受體有關(guān)[16]。丹參酮ⅡA可通過雌激素受體介導(dǎo)激活蛋白激酶B并抑制Leu27IGF-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞中胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)受體信號激活的細胞凋亡作用，表明丹參酮ⅡA用于預(yù)防心肌細胞凋亡和心血管疾病的治療，而不會增加患乳腺癌的風險[17]，且可以通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)-2信號通路抑制血小板活化，改善血液微循環(huán)，減輕脂質(zhì)沉積，從而預(yù)防心腦血管疾病[18-19]。維斯體素通過干預(yù)中性粒細胞發(fā)揮抗炎作用[20]。柚皮素也具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗氧化、抗炎、抗癌，可干預(yù)骨再生、代謝綜合征、氧化應(yīng)激損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病[21]。動物實驗提示，柚皮素可上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)、過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活因子α(PGC-1α)等蛋白表達，抑制PI3K/Akt/Sirt1信號通路，從而減輕心肌損傷，保護心臟[22]。

繪制丹參飲有效成分-擴張型心肌病網(wǎng)絡(luò)圖，進行度值分析，發(fā)現(xiàn)SCN5A、ADRB2、ESR1、NOS2、PPARG、CHRM2、ADRA1D、PDE3A、NOS3、MAPK14是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，丹參飲可能通過作用于這些靶點發(fā)揮治療作用。SCN5A參與編碼心肌細胞電壓門控Na+通道基因，SCN5A基因突變，導(dǎo)致離子水平失衡，與擴張型心肌病病因相關(guān)[23]。ADRB2與特發(fā)性擴張型心肌病相關(guān)，具有調(diào)節(jié)心率和心肌收縮的作用[24]，ADRB2過度甲基化誘導(dǎo)的β2腎上腺素能受體，抑制PI3K/Akt通路，進而導(dǎo)致心功能不全，ADRB2去甲基化可能是預(yù)防心臟損傷的新靶標[25]。ESR1不僅作用于生殖系統(tǒng)，對于心血管系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，ERK1/2/成骨細胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)磷酸化抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)開放的級聯(lián)反應(yīng)，可能在小鼠心肌缺血-復(fù)灌損傷中起關(guān)鍵作用[26]。

富集分析結(jié)果顯示，丹參飲涉及的生物學(xué)過程復(fù)雜，發(fā)揮治療作用可能相關(guān)的通路較多，主要包括心血管系統(tǒng)(如HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路)、炎癥過程和免疫抑制(如TNF信號通路、T細胞受體信號傳導(dǎo)途徑、MAPK 信號通路)等。HIF-1信號通路，可以促進血管新生，上調(diào)與血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因表達，恢復(fù)組織血流，降低缺血性損傷[27]。PI3K-Akt信號通路在細胞存活與凋亡、心電生理和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用，是控制心肌細胞存活和功能重要的促增殖及抗凋亡信號通路之一[28]。鈣信號通路與動脈鈣化、心肌收縮功能、代謝調(diào)節(jié)等關(guān)系密切[29-31]。TNF信號通路可以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。MAPK信號通路在介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可以干預(yù)動脈粥樣硬化，調(diào)控血小板功能[32]。

綜上所述，擴張型心肌病病因復(fù)雜，疾病對應(yīng)靶點多樣，客觀分析疾病靶點作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達到針對性治療的效果。丹參飲成分多樣、靶點復(fù)雜、通路交錯，關(guān)鍵節(jié)點大有牽一發(fā)而動全身的效果，把握關(guān)鍵點靈活調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用機制。初步的分析表明，丹參飲可能通過抗炎、抗氧化、保護血管、調(diào)控心肌細胞等發(fā)揮治療擴張型心肌病的作用，從一定程度上闡述了丹參飲的作用機制，也為后續(xù)的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和探索方向。限于研究方法的局限性，中藥成分、疾病及藥物靶點有待完善，單藥炮制、復(fù)方煎煮、人體吸收等一系列過程，組分間復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)尚未明確，丹參飲治療擴張型心肌病確切作用靶點及作用通路需進一步實驗驗證。