參術寧心方對心房顫動大鼠炎癥反應拮抗作用的實驗研究

劉 攀，方才敬，戴小華

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的心律失常，是發生心肌梗死、肺栓塞、腦梗死等危急重癥的危險因素[1]。引起AF的風險因素眾多，研究發現的確定因素包括高血壓、超重、飲酒、吸煙、糖尿病等[2]；除此之外，心房增大、冠心病、心肌梗死等心臟病變可誘發AF，且心臟發生器質性改變使AF得以維持[3]。研究表明，中醫藥在“整體觀”和“治未病”的理論指下，通過多靶點作用，治療心血管原發病的同時可預防AF及其并發癥的發生[4-5]。除此之外，當AF發生時，心房細胞處于缺血缺氧狀態下，炎癥反應加重心肌纖維化[6]。因此，對于AF，可從拮抗炎癥反應角度進行預防和治療，尤其是射頻消融術后，預防AF的再發成為中醫藥防治本病的研究熱點。安徽中醫藥大學第一附屬醫院心內科在防治AF方面有豐富的臨床經驗，善用“調脾護心、安神定悸”法，注重調護脾胃以求“母病救子”“實子補母”和“未病先防”。前期數據挖掘已總結出臨床核心處方參術寧心方，網絡藥理學是基于大數據對藥物成分靶點、疾病靶點、核心差異基因分子功能、信號通路進行數據化分析，可發現藥物作用于疾病時的有效成分、具體靶點、分子通路，構建藥物-疾病靶點網絡[7]，為臨床研究藥物干預疾病提供參考。本研究探討參術寧心方對AF大鼠炎癥反應的拮抗作用和網絡藥理學機制，為中醫藥臨床防治AF提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠59只，購自安徽醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證：SCXK(皖)2017-001)，其中預實驗9只，經預實驗驗證體重選擇250～300 g尾靜脈注射最適宜，雄性，12周齡；每籠2～4只大鼠飼養，為排除環境影響，所有大鼠實驗前飼養1周，全過程標準化飼養，飲食充足，墊料清潔，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.2 藥物

1.2.1 中藥 參術寧心方：沙參10 g，甘松8 g，丹參10 g，人參6 g，陳皮15 g，白術20 g，黨參10 g，酸棗仁20 g等，顆粒劑由安徽中醫藥大學第一附屬醫院提供，均由廣州一方藥業生產，開水沖解，濃度為1 g/mL，給藥劑量經人鼠換算公式[大鼠劑量=成人劑量(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g]計算為24.23 g/(kg·d)。

1.2.2 西藥 胺碘酮由杭州賽諾菲圣德拉堡民生藥業生產，溫水溶解，以臨床成人最大維持劑量1.5倍溶解，濃度為10.8 mg/mL，給藥劑量經人鼠換算公式計算為54 mg/(kg·d)；麻醉劑(乙氟烷-大小鼠麻醉機用乙氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產)：維持濃度為2.0%～2.5%，流量為500～700 mL/min麻醉。AF大鼠模型復制：新配乙酰膽堿-氯化鈣溶液(Ach-CaCl2)按Ach 99 μg/mL+CaCl210 mg/mL(Ach的CAS號：60-31-1，購自上海笛柏生物科技有限公司；CaCl2的生產批號：1807142，購自西隴科學股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 網絡藥理數據庫研究 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索參術寧心方各中藥成分[以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為限制條件]及其作用靶點；使用Cytoscape 3.8.0制作中藥成分-靶點圖，可視化中藥成分-靶點之間的具體聯系；使用Gene Cards數據庫搜索AF相關靶點，得到疾病靶點，并以Score≥5.0為限制條件；將中藥靶點、疾病靶點取交集，得到交集基因；使用STRING數據庫，以置信度≥0.4為限制條件，對交集基因進行分析，得到蛋白質-蛋白質互作(PPI)圖，并保存為TSV格式，使用Cytoscape 3.8.0對PPI進行可視化處理；使用DAVID數據庫對交集基因進行Gene Symbol轉化，轉換為ENSG格式，使用Omic Share平臺對交集進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。

1.3.2 預實驗 參考文獻[8]進行陣發性AF大鼠模型復制，探索適宜尾靜脈注射的大鼠體重，取200 g、250 g、300 g、330 g大鼠各3只，特制大鼠固定→尾部40 ℃溫水加熱→酒精消毒(同時擴張尾靜脈)→1 mL注射器平刺進針→回抽(以注射器內進血為準)→注射Ach-CaCl2溶液0.1 mL/100 g，每日1次，連續7 d，最后一次尾靜脈注射前麻醉大鼠，測大鼠標準二導聯心電圖，確認尾靜脈穿刺準確后注射藥液，同時標記注射時間點，以心電圖P波消失，代之以連續的f波，心律絕對不齊為造模成功。經驗證大鼠體重在250～300 g尾靜脈注射最適宜，基于數據挖掘的參術寧心方干預Ach-CaCl2誘導AF大鼠的實驗研究造模成功率高，造模方案可行。預實驗使用后的大鼠不參加正式實驗。

1.3.3 動物造模及分組 將50只雄性SD大鼠隨機分為預防組、西藥組、中藥組、模型組和正常組，各10只；尾靜脈注射Ach-CaCl2溶液0.1 mL/(100 g·d)連續7 d造模。中藥組按預實驗方案進行AF模型大鼠復制，參術寧心方按劑量24.23 g/(kg·d)灌胃，第8天起，每日灌胃后1 h，尾靜脈注射Ach-CaCl2溶液，連續14 d；西藥組給予胺碘酮54 mg/(kg·d)灌胃；模型組灌胃生理鹽水2 mL/(kg·d)；預防組先給予參術寧心方24.23 g/(kg·d)灌胃，連續14 d，第15天起，每日灌胃生理鹽水2 mL/(kg·d)，1 h后尾靜脈注射Ach-CaCl2溶液，至第21天，保證藥物干預時間和尾靜脈注射造模藥物時間相同；正常組灌胃等量生理鹽水，尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3.4 實驗前后標準Ⅱ導聯心電圖的收集 ①實驗前各組大鼠理想狀態下均麻醉劑采用維持濃度為2.0%～2.5%、流量為500～700 mL/min麻醉，連接生物信號采集系統描計標準Ⅱ導聯心電圖，待心電圖描計清晰后，持續記錄5 min，排除心律失常大鼠。②確認AF模型是否成功：尾靜脈注射Ach-CaCl2溶液7 d后，在大鼠麻醉狀態下連接生物信號采集系統，描計尾靜脈注射造模藥液后標準Ⅱ導聯心電圖，保留造模成功大鼠。③最后1次灌胃后1 h，采用同樣方法收集心電圖，電腦標記注射時間，整理數據，以A點為起始點，B點為大鼠出現典型AF心電圖時間點，C點為大鼠AF消失時間點，利用計算機計算TAB(A點至B點的時間)、TBC(B點至C點的時間)，為大鼠AF誘發時間，TBC為大鼠AF持續時間。

1.3.5 血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)水平檢測 試驗結束后，大鼠禁食水10 h，麻醉狀態下，腹主動脈取血，每只取血量約4 mL，0 ℃冰塊中靜置15 min，離心，取上層血清，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.3.6 心肌Masson染色 腹主動脈取血后，摘取心臟標本，置于4%多聚甲醛固定(固定時間24 h，于4 ℃恒溫冰箱內)，石蠟包埋。技術路線：石蠟切片脫蠟至水→重鉻酸鉀染色→鐵蘇木素染色→麗春紅酸性品紅染色→磷鉬酸染色→苯胺藍染色→分化→透明封片顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2 結 果

2.1 大鼠狀態 各組大鼠活動靈敏，呼吸均勻，皮毛有光澤。中藥組和西藥組大鼠尾靜脈注射后呼吸、心率加快，目光呆滯，眼睛充血，5～7 min恢復，呈乏力、喜倦臥，西藥組輕度食欲減退，中藥組無明顯食欲減退；預防組大鼠尾靜脈注射后呼吸、心率加快，動作遲緩，眼睛充血，4～5 min恢復，呈乏力狀態，飲食正常；模型組尾靜脈注射后腹式呼吸加快，心率加快，眼睛充血，動作遲鈍，13～19 min恢復，呈乏力、喜倦臥，食欲減退，體重減輕；正常組驚嚇后心率、呼吸加快，可以很快恢復，無明顯其他改變。各組大鼠存活及死亡情況詳見表1。

表1 各組大鼠實際存活及死亡情況 單位：只

2.2 AF大鼠模型的制備 實驗第7天，除正常組及死亡大鼠外的其余大鼠均可誘發AF。各組大鼠在經歷不同的心律失常后出現典型的AF心電圖(標準Ⅱ導聯P波消失，代之以連續的f波，心律絕對不齊)，最后恢復為竇性心律，實驗各項數據的收集嚴格以標準的AF心電圖為準。詳見圖1。

圖1 大鼠心電圖變化(A為實驗前大鼠正常心電圖；B為由竇性心律轉為AF心律；C為尾靜脈注射造模藥液后大鼠出現AF心律；D為由AF心律轉為竇性心律)

2.3 各組AF誘發時間和持續時間比較 與模型組相比，預防組、中藥組、西藥組大鼠AF誘發時間均延長(P<0.05)，其中預防組AF誘發時間最長[(3.26±0.46)s]，說明提早灌胃中藥具有預防AF的作用；西藥組AF誘發時間較中藥組延長(P<0.05)，提示胺碘酮的防治效果較好。預防組、中藥組、西藥組AF持續時間較模型組明顯縮短(P<0.05)，提示胺碘酮和參術寧心方可縮短AF持續時間；中藥組、西藥組AF持續時間與預防組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示參術寧心方在發生AF前后干預可對大鼠AF持續時間產生不同效果；中藥組與西藥組AF持續時間比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠AF誘發時間和持續時間比較(±s) 單位：s

2.4 各組血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比較 預防組、中藥組、西藥組血清TNF-α、IL-1、IL-6水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；中藥組、西藥組TNF-α、IL-1、IL-6水平與預防組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示參術寧心方在發生AF前后干預可對大鼠AF炎癥反應產生不同拮抗作用；中藥組TNF-α、IL-1、IL-6水平均低于西藥組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.5 心肌(心房)Masson染色 在Masson染色中，膠原纖維被苯胺藍染色呈現藍色，肌纖維被酸性品紅和麗春紅染色呈紅色，紅細胞呈現橘紅色，通過這種染色方法可定性、定量顯示組織或者炎癥的修復與纖維化程度，藍色區域在視野內占比越高，則心肌間新生膠原纖維越多，心房纖維化就越嚴重，反之則輕。所有鏡下圖片取相同放大倍數。正常組心肌細胞排列整齊，形狀橢圓，外基質中少許正常點狀藍色區域，為正常膠原結構；模型組視野內細胞排列紊亂、間隙增大，形狀異怪，藍色區域密集且染色深，呈片狀分布，心肌纖維化程度最高；預防組細胞部分異形，排列尚整齊，除正常細胞結果外，藍色區域較正常組多，點狀分布，離散存在，新生心肌纖維化成分較模型組少，鏡下病理改變情況好于中藥組，說明預防組能更好地預防心肌纖維化；西藥組細胞排列大部分正常，形狀可，整體橘紅色，藍色區域點狀分布，即正常組織多，纖維化程度較模型組低；中藥組少部分片狀區域紊亂，組織點片狀壞死，顏色深淺不齊，心肌間質水腫，視野整體暗紅色，紅色小點塊區域較多，藍色區域呈條狀散在分布，說明膠原纖維和肌纖維較正常組多，但少于模型組。詳見圖2。

圖2 各組大鼠AF心肌纖維化情況(×400，50 μm)

2.6 網絡藥理學機制研究 通過TCMSP搜索參術寧心方各中藥成分及其作用靶點并進行PPI分析：成分-靶點分析可見參術寧心方藥物作用靶點集中在炎癥相關基因位點，其中一氧化氮合酶3(NOS3)、IL-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、內皮素1(EDN1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)靶點與細胞能量代謝和炎癥反應密切相關，提示本方可調控炎癥反應，詳見圖3、圖4；KEGG分析顯示：藥物靶點基因密集在晚期糖基化產物(AGE)-晚期糖基化產物受體(RAGE)、MAPK、白介素(IL)、TNF信號通路，驗證了參術寧心方拮抗AF炎癥反應的藥理學效應，詳見圖5、圖6。

圖4 PPI互作和網絡拓撲分析(A為PPI互作圖；B為網絡拓撲分析圖。節點代表靶點，連線代表相互作用，顏色及大小代表頻次)

圖5 KEGG富集分析(圖形節點代表通路，長短和大小代表靶點數目，顏色代表P值)

圖6 主要信號通路關系

3 討 論

AF為臨床中最常見的心律失常，是腦卒中和心血管危急重癥的危險因素[9]，國家大力增建“房顫中心”以救治AF病人，AF的防治成為研究的熱點。目前，對于AF病人，及時的藥物抗凝、減慢心率可減少AF的并發癥[10]，特別是射頻消融術，能有效阻斷AF發生異常心電活動[11]，但是AF的復發性和具體機制尚不明確[12]，臨床對本病的防治面臨決策難題。其中，心房的快速起搏和心室重構使心房細胞處于缺血缺氧環境，心臟組織發生炎癥反應，心肌纖維化進一步加重，互為因果。

中醫藥防治本病歷史悠久，療效確切。《本草綱目》中“參類養心”啟發近現代醫者如何防治本病，其中經典治法“調脾護心、安神定悸”臨床療效顯著。在《難經》中有： “脈來上大下兌，啄啄連屬”如是描述，近現代醫家根據其心慌、脈搏短絀等臨床表現，可將其歸屬于心悸范疇。本病病位在心，和脾胃相關，心與脾胃乃“母子”關系，在五行、經絡和臟腑功能等方面由此及彼。基本病機屬本虛標實，本虛為心之氣血陰陽虧虛，標實相連于痰飲、瘀血、火熱、寒邪等相關[13]。大量研究在辨證論治的基礎上，治法不相同，但都趨于相同病因病機為大綱，其中，調脾護心、養心定悸法療效確切[14]。參術寧心方立意源自孫思邈《備急千金要方》：“心勞病者，補脾氣以益之，脾旺則感于心矣”，以益氣健脾、養心定悸為基本治則治法。參術寧心方以黨參、人參、丹參、沙參和白術為君藥，意在“參類補氣、益氣、養心”和白術補氣健脾，注重調脾護心和“母病救子”；酸棗仁養心安神，甘松理氣止痛，與君藥形成補氣不忘理氣之功， 兩藥相伍既理氣，又養心血，共為臣藥；遠志寧心安神、祛痰開竅，陳皮理氣健脾、燥濕化痰，竹茹清熱化痰，三藥合用佐助君藥養心、祛實邪為佐藥；蒲公英輕清而性甘，升舉而調和諸藥為使藥。

從現代藥理研究來看，黨參可抑制過度激活的鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶A，抑制L型鈣電流、Na+-Ca2+交換體電流等內向電流重構，從而抑制異常觸發活動的發生，進而抗心律失常[15]。人參、丹參、沙參含人參皂苷，具有抗心肌縫隙連接重塑、抑制 Ca2+-K+離子通道等抗心律失常的作用[16]。白術內酯可抑制炎性因子 TNF-α、白介素-1β(IL-1β)和 IL-6 的表達，從而發揮抗炎活性，并可抑制 MAPK和核轉錄因子(NF-κB)的活化，從而減少AF的發生[17]。酸棗仁可對心肌細胞電生理產生影響，降低心律失常發生率，并可減少 5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)含量，從而起到抗抑郁、鎮靜的作用[18]。甘松新酮可影響環磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)傳導通路，明顯抑制大鼠心肌細胞的快速搏動，可對抗快速性心律失常[19]。陳皮及其成分可較強地改善心腦血管疾病的作用，如心腦保護、抗動脈硬化、抗血栓等，其中橙皮苷、柚皮苷具有很強的抗炎及抗氧化作用[20]。蒲公英可阻滯血小板聚集，并且蒲公英多酚在一定濃度范圍內對自由基有較高的清除率，有較強抗氧化能力，從而降低AF發生率[21]。竹茹多糖可作為免疫促進劑，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[22]。遠志寡糖酯可通過調節氨基末端激酶(JNK)、MAPK和NF-κB信號通路，抑制巨噬細胞中產生一氧化氮、前列環素E2、環氧化酶-2及促炎因子TNF-α和白介素1β，可發揮抗炎作用，繼而減少AF發生[23]。網絡藥理方法進行成分-靶點分析可見參術寧心方藥物作用靶點集中在炎癥相關基因位點，其中NOS3、IL-6、IL-1、TNF、VEGFA、EDN1、MAPK靶點與細胞能量代謝和炎癥反應密切相關；KEGG分析結果顯示，藥物靶點基因密集在AGE-RAGE、MAPK、IL、TNF信號通路，驗證了參術寧心方拮抗AF炎癥反應的藥理學效應；從實驗結果來看，參術寧心方能延長大鼠AF誘發時間(P<0.05)，縮短AF持續時間(P<0.05)，降低AF大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平(P<0.05)，減輕心肌纖維化程度。

綜上所述，參術寧心方內含有人參皂苷、白術內酯、甘松新酮、竹茹多糖、遠志寡糖酯等多種物質，有效延長大鼠陣發性AF誘發時間，縮短AF持續時間，通過拮抗炎癥作用減輕心肌組織纖維化，與AGE-RAGE、MAPK、IL、TNF信號通路相關。